地黃低聚糖對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療豬心肌梗死后心力衰竭的實驗研究.pdf

1、目的：探索小型豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)分離、培養(yǎng)的方法；并證明ADMSCs在5-氮雜胞苷(5-aza)誘導(dǎo)下可分化為心肌細(xì)胞；證明地黃低聚糖對ADMSCs的促增殖作用及測定培養(yǎng)ADMSCs的最佳RGOs濃度；構(gòu)建小型豬心肌梗死后心力衰竭動物模型；探討同種異體移植ADMSCs在心肌梗死區(qū)存活并分化為心肌細(xì)胞的情況；初步觀察ADMSCs移植對小型豬心肌梗死后心功能的影響及其可能機(jī)制。為心肌細(xì)胞成形術(shù)提供移植干細(xì)胞新的種子來源，為臨

2、床應(yīng)用ADMSCs移植治療急性心肌梗死后心力衰竭提供實驗與理論依據(jù)。 方法： 第一部分 (1)小型豬ADMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定：無菌條件下取小型豬腹部皮下脂肪組織，采用胰酶加Ⅰ型膠原酶消化法及貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察；取第3代細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖溶液(PBS)為空白對照，進(jìn)行CD13，CD44，CD105，CD34，CD45，HLA-DR，Ⅷ因子表面抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定； (2)ADMSCs的體

3、外誘導(dǎo)及鑒定：對第3代細(xì)胞行5-aza誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并以PBS為空白時照，進(jìn)行α-actin及cTnT的表達(dá)情況的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。 第二部分、測定培養(yǎng)ADMSCs最佳地黃低聚糖濃度 分別將第3代ADMSCs及5-aza誘導(dǎo)后ADMSCs以不同濃度的含地黃低聚糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，用細(xì)胞計數(shù)法測定不同濃度含地黃低聚糖培養(yǎng)基的細(xì)胞生長曲線，探討促細(xì)胞增殖的最佳地黃低聚糖濃度。 第三部分、同種異體ADMSCs移植治

4、療小型豬心肌梗死后心力衰竭的實驗研究 采用冠狀動脈結(jié)扎法構(gòu)建小型豬急性MI模型，無菌操作下開胸于前降支分出第一對角支下約0.5cm處結(jié)扎冠狀動脈，分別經(jīng)心外膜在梗死區(qū)域注射細(xì)胞，將小型豬隨機(jī)分為4組，即PBS對照組、ADMSCs移植組、誘導(dǎo)后ADMSCs移植組和誘導(dǎo)后RGOs培養(yǎng)ADMSCs移植組。分別于移植前、移植后1周及移植后4周行超聲心動圖檢查，移植后4周行血流動力學(xué)檢查，并處死動物取心臟標(biāo)本，分別行免疫熒光化學(xué)觀察移植細(xì)

5、胞存活、分化情況及免疫組織化學(xué)α-actin、cTnT檢測、測定血管密度和膠原容積分?jǐn)?shù)。 結(jié)果： (1)小型豬皮下脂肪組織中含有大量長梭形細(xì)胞，成螺旋形生長，免疫化學(xué)鑒定顯示與空白對照相比較細(xì)胞表面分子抗原CD13、CD44、CD105呈陽性反應(yīng)，CD34、CD45、HLA-DR和Ⅷ因子均為陰性反應(yīng)。10umol/L的5-aza誘導(dǎo)24小時后更換含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞排列呈放射狀，多數(shù)細(xì)胞為長梭形

6、，部分細(xì)胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則星狀或桿狀，細(xì)胞體積及胞核變大，有不同方向的長釘狀突起伸出，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)。與空白對照比較28d后多數(shù)細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示α-actin、cTnT呈陽性反應(yīng)。 (2)RGOs可促進(jìn)第3代ADMSCs及5-aza誘導(dǎo)后ADMSCs增殖。這種效應(yīng)為反映在指數(shù)增長期提前，細(xì)胞分裂數(shù)量增加，在較低濃度時，促增殖效應(yīng)呈劑量依賴性。但是給予高濃度時，并不能進(jìn)一步促進(jìn)ADMSCs增殖，細(xì)胞分裂數(shù)量減少。各組細(xì)胞接

7、種第2至第6天為對數(shù)生長期，笫7天已達(dá)峰值，7天以后進(jìn)入生長平臺期，細(xì)胞數(shù)目不再增加。培養(yǎng)第3代ADMSCs及5-aza誘導(dǎo)后ADMSCs的最佳RGOs均為200mg/L。 (3)移植后4周DAPI陽性的ADMSCs可見于梗死邊緣區(qū)及梗死區(qū)，且分化為α-actin、cTnT免疫組化結(jié)果呈陽性的細(xì)胞；移植后4周，與對照組比較，ADMSCs移植組、誘導(dǎo)后ADMSCs移植組和誘導(dǎo)后RGOs培養(yǎng)ADMSCs移植組LVEF、LVSP、+d

8、p/dtmax和血管密度均增加；左室重構(gòu)指數(shù)和LVEDV、LVESV、LVEDP、-dp/dtmax、梗死區(qū)及非梗死區(qū)膠原容積分?jǐn)?shù)均減少。且與ADMSCs移植組、誘導(dǎo)后ADMSCs移植組比較，誘導(dǎo)后RGOs培養(yǎng)ADMSCs移植組LVEF、LVSP、+dp/dtmax和血管密度均增加；左室重構(gòu)指數(shù)、LVEDP，-dp/dtmax、梗死區(qū)及非梗死區(qū)膠原容積分?jǐn)?shù)均減少。 結(jié)論：小型豬脂肪組織中含有間充質(zhì)干細(xì)胞，且ADMSCs可在5-a