四分子交聯(lián)體5與大腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系.pdf

1、大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。本研究用基因芯片技術(shù)篩選三株具有不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞株的差異表達(dá)基因，從中挑選出Tspan-5作為研究對象，從分子和細(xì)胞水平深入探討該基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，旨在研究對大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，不僅有利于闡明大腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，而且還能為臨床上預(yù)測轉(zhuǎn)移、基因治療和預(yù)后判斷尋找新的有效靶點。 一、基因芯片技術(shù)篩選三株具不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞株的差異表達(dá)基因，確定研究目

2、的基因，驗證基因芯片檢查結(jié)果 1、確定三個細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力的差異用異質(zhì)粘附實驗和趨化運(yùn)動實驗確定LST-R1、SW480和Lovo三個細(xì)胞株之間轉(zhuǎn)移能力的差異。異質(zhì)粘附實驗的粘附介質(zhì)用collagenIV，細(xì)胞濃度為1×108／L，37℃、50mL／LCO2孵育1h。趨化運(yùn)動實驗用8μm孔徑的transwell小室，趨化因子用NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清制備，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108／L，按200μL／上室加入細(xì)胞懸液，下室每室加50

3、0μLNIHSTS細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃、50mL/CO2孵育6h。結(jié)果顯示，LoVo、SW480和LST-R1三個細(xì)胞株基底膜粘附性有差異，F(xiàn)=84.279，P<0.001。其中，LST-R1粘附細(xì)胞數(shù)顯著少于LoVo(P<0.001)和SW480(P<0.001)，LoVo的粘附細(xì)胞數(shù)多于SW480(P<0.01)。粘附性強(qiáng)弱順序為LST-R1

4、。其中，LST-R1運(yùn)動性弱于LoVo和SW480(P<0.001)，SW480運(yùn)動性弱于LoVo(P<0.001)。運(yùn)動性強(qiáng)弱順序為LST-R12或個<2而另個>10；信號值變異系數(shù)<0.33；信號平均值有2倍以上表達(dá)差異作為判定基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。在顯著表達(dá)上調(diào)的基因中與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因主要有：發(fā)動蛋白

5、2(Dynamin2)、ADP-核糖基化因子1(ARF1)。在顯著下調(diào)表達(dá)的基因中，與轉(zhuǎn)移有關(guān)系的有跨膜4超家族成員9(transmenbrance4superfamily9，TM4SF9)，又稱四分子交聯(lián)體5(Tetraspan-5)。Tspan-5在結(jié)腸癌中的表達(dá)，為本研究首次報道，選擇該基因作為研究對象。 3、基因水平驗證基因芯片結(jié)果用半定量RT-PCR技術(shù)，結(jié)果顯示Tspan-5mRNA在三個細(xì)胞株中的表達(dá)水平差異與基因

6、芯片檢測結(jié)果相符。 4、蛋白水平驗證基因芯片結(jié)果細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)定性，免疫印跡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)定量研究。結(jié)果顯示TSpan-5蛋白表達(dá)水平差異與基因芯片檢測結(jié)果相符。 5、臨床大腸癌組織樣本免疫組化研究：Tspan-5表達(dá)水平在正常大腸粘膜和息肉呈低表達(dá)或陰性，在有不典型增生的腺瘤組織中，Tspan-5表達(dá)相對于正常大腸粘膜和息肉開始升高，而在大腸癌組織中顯著升高，同時轉(zhuǎn)移癌的表達(dá)水平高于原發(fā)癌(Z=

7、109.859，P<0.001)。Tspan-5表達(dá)水平高的病人3年生存率低于Tspan-5表達(dá)水平低的病人(X2=6.237，P=0.013)。 二、體外實驗觀察改變Tspan-5表達(dá)水平對結(jié)腸癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)行為的影響 1、克隆LoVo細(xì)胞Tspan-5基因，轉(zhuǎn)染LST-R1細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建Tspan-5／pEGFP-C1重組質(zhì)粒，用Lipofectamine2000TM.轉(zhuǎn)染入LST-R1細(xì)胞，同

8、時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1質(zhì)粒做對照。轉(zhuǎn)染后的LST-R1細(xì)胞在300μg／mLG418培養(yǎng)環(huán)境里穩(wěn)定存活。Western-Blot檢測顯示轉(zhuǎn)染Jspan-5／pEGFP-C1重組質(zhì)粒的LST-R1中有Tspan-5-GFP融合蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C1質(zhì)粒的LST-R1細(xì)胞則無。激光共聚焦顯微鏡證明表達(dá)的Tspan-5GFP融合蛋白定位在細(xì)胞膜上，而GFP蛋白則定位在胞漿。 2、RNAi下調(diào)LoVo細(xì)胞Tspan-5表達(dá)設(shè)計

9、shRHA片段，構(gòu)建質(zhì)粒，用Lipofectamine2000TM導(dǎo)入LoVo細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，干擾Tspan-5表達(dá)。免疫蛋白印跡檢測證明干擾成功，LoVoTspan5／453和LoVoTspan-5／372細(xì)胞Tspan-5蛋白表達(dá)水平顯著下降。選擇干擾效果最明顯的LoVoTspan5／453進(jìn)行下一步研究。 3、異質(zhì)粘附實驗實驗結(jié)果顯示：改變Tspan-5表達(dá)水平后，細(xì)胞基底膜主要成份CollagenIV、FN、LN

10、、VN粘附能力均發(fā)生改變，上調(diào)Tspan-5表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞基底膜粘附性，下調(diào)Tspan-5表達(dá)則降低細(xì)胞的基底膜粘附性，其中改變Tspan-5表達(dá)水平對CollagenIV的粘附能力降低最明顯。 4、趨化運(yùn)動實驗實驗結(jié)果顯示：改變Tspan-5表達(dá)水平后，細(xì)胞CollagenIV、FN、LN、VN趨化運(yùn)動能力均發(fā)生改變，以CollagenIV為明顯。上調(diào)Tspan-5表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動性，下調(diào)Tspan-5表達(dá)則降低細(xì)胞的運(yùn)動性

11、。 5、劃痕實驗實驗結(jié)果顯示：改變Tspan-5表達(dá)水平后，大腸癌細(xì)胞在CollagenIV上的劃痕愈合能力發(fā)生改變，下調(diào)Tspan-5表達(dá)可顯著抑制大腸癌細(xì)胞在CollagenIV上的劃痕愈合能力。 三、整合素與Tspan-5的相互作用 l、整合素功能阻斷和激活單獨阻斷整合素β1和Tspan-5表達(dá)，LoVo細(xì)胞的CollagenIV粘附能力下降分別為65％和55％，聯(lián)合阻斷后，LoVo細(xì)胞的CollagenI

12、V粘附能力下降64％：單獨激活整合素β1表達(dá)，LoVo細(xì)胞的CollagenIV粘附能力上升40％，激活已阻斷Tspan-5表達(dá)的LoVo細(xì)胞，其CollagenIV粘附能力上升38％。聯(lián)合阻斷Tspan-5和整合素β1，其抑制LoVo細(xì)胞的CollagenIV粘附能力的作用沒有明顯疊加；阻斷Tspan-5的表達(dá)，對激活整合素β1的LoVo的CollagenIV粘附能力無明顯影響。此研究結(jié)果提示，Tspan-5對大腸癌細(xì)胞的Collag

13、enIV粘附能力的主要與整合素β1有關(guān)。 2、Western-Blot敲低Tspan-5表達(dá)對整合素β1的表達(dá)無顯著影響，但可以顯著抑制PIP2的表達(dá)。 3、免疫共沉淀大腸癌細(xì)胞株LoVo和SW620中，整合素β1可以被Tspan-5抗體沉淀。 4、免疫熒光雙染色Tspan-5和整合素β1在大腸癌細(xì)胞株LoVo和SW620中存在共定位。 四、體內(nèi)實驗觀察Tspan-5敲除對大腸癌細(xì)胞裸鼠肝轉(zhuǎn)移能力的影響脾

14、臟保留法建立裸小鼠肝臟轉(zhuǎn)移模型，用LoVoTspan-5／N和LoVoTspan-5／453細(xì)胞，3周處死小鼠，HE染色，光鏡下見癌細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布，無腺腔樣結(jié)構(gòu)，胞漿豐富，核大不規(guī)則，核仁明顯，可見多核瘤巨細(xì)胞，核分裂像易見，符合低分化腺癌的結(jié)構(gòu)特征(圖3-9)。雖然敲除Tspan-5表達(dá)未能阻止轉(zhuǎn)移發(fā)生，但是LoVoTspan-5／453組肝臟表面結(jié)節(jié)數(shù)低于LoVoTspan05／N(Z=-2.259，P<0.001) 通過

15、以上研究可以得出以下結(jié)論： 1、LST-R1、SW480及LoVo細(xì)胞株具有不同轉(zhuǎn)移潛能，LoVo>SW480>LST-R1。 2、LST-R1、SW480、LoVo細(xì)胞Tspan-5表達(dá)水平有差異，LoVo>SW480>LST-R1。 3、Tspan-5的表達(dá)水平與大腸癌的進(jìn)展呈正相關(guān)，Tspan-5表達(dá)高的病人3年生存率低于Tspan-5表達(dá)水平低的病人； 4、改變Tspan-5表達(dá)水平可以改變結(jié)腸癌