大鼠三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核內(nèi)Cdk5-p39的表達(dá)與活性.pdf

1、周期依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)是Cdks家族成員之一,屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,由于Cdk5具有與其他Cdk成員同源序列而得名。其最早從哺乳動(dòng)物腦中精制出來,并確定了很多特性。Cdk5單體形式?jīng)]有激酶活性,只有與調(diào)節(jié)因子蛋白p35或p39結(jié)合才表現(xiàn)酶活性,p39和p35是Cdk5不可缺少的激活劑。在大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育時(shí)期,p39和p35表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。在時(shí)間上,p39的表達(dá)總要比p

2、35的表達(dá)遲一到二周；在空間上,p39主要表達(dá)于小腦,而p35主要表達(dá)在海馬和初級(jí)嗅皮質(zhì)。在神經(jīng)元亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上,p39表達(dá)于神經(jīng)元的細(xì)胞體和軸突,而p35只表達(dá)神經(jīng)元的細(xì)胞體,p35和p39在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)差別,提示p35和p39具有不同的作用機(jī)理。
　　 p39和p35的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)對(duì)于Cdk5/p35和Cdk5/p39調(diào)節(jié)神經(jīng)元正常生長分化,遷移以及突觸的形態(tài)和功能的整塑等具有不同的作用特點(diǎn)。當(dāng)神經(jīng)元開始極化時(shí),Cdk5改

3、變其亞細(xì)胞定位從細(xì)胞體到軸突,p35只表達(dá)神經(jīng)元的細(xì)胞體,Cdk5/p35對(duì)于神經(jīng)元的生長分化有著重要作用,而p39表達(dá)于神經(jīng)元的軸突,表明Cdk5/p39對(duì)于晚期神經(jīng)元軸突的生長分化有著重要的意義。樹突棘是突觸的重要結(jié)構(gòu),p35、p39均缺乏或Cdk5缺乏的海馬神經(jīng)元樹突棘形態(tài)發(fā)育不全并且密度大大減少,而在p35缺乏的海馬神經(jīng)元,樹突棘的發(fā)育形態(tài)正常而樹突棘的突觸活動(dòng)能力明顯減弱,表明了樹突棘引起的突觸活動(dòng)主要依賴于Cdk5/p35的

4、活性。在調(diào)節(jié)突觸囊泡的分泌作用上,Cdk5/p35主要通過和神經(jīng)突觸前膜胞內(nèi)蛋白-18(Munc-18)結(jié)合,并且磷酸化Munc-18,阻止Munc-18和突觸融合蛋白1A(syntaxin 1A)的結(jié)合,促進(jìn)囊泡的分泌,而Cdk5/p39主要通過磷酸化Munc-18促使囊泡外Ca離子內(nèi)流,從而促進(jìn)囊泡分泌。Cdk5/p35和Cdk5/p39的上述差別,表明了它們?cè)谡{(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育中有著不同作用。此外,Cdk5/p39相對(duì)于Cdk

5、5/p35穩(wěn)定性較弱,Triton X-100洗滌劑便可以將純化的Cdk5/p39失活,而Cdk5/p35則不會(huì)。Cdk5/p39的復(fù)合物活性調(diào)節(jié)主要是依賴于Cdk5蛋白和p39蛋白的結(jié)合和解離,而Cdk5/p35的活性調(diào)節(jié)主要是依賴于p35蛋白的降解和合成。
　　 三叉神經(jīng)痛(Trigeminal neuralgia,TN)是一種以慢性、陣發(fā)性的面部疼痛為特征的疾病,TN的發(fā)病機(jī)制仍不甚明了。三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(Spina

6、ltrigemihal caudal subnucleus,Vc)是外周傷害性信息向中樞傳人的門戶,是接受面口部傷害性刺激信息并將此信息向中樞傳導(dǎo)的中繼站。Vc內(nèi)含有多種傳遞疼痛神經(jīng)肽的陽性纖維末端,它們大部分來源于三叉神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞,并且與Vc淺層內(nèi)分布著大量的神經(jīng)元的胞體和突起形成突觸聯(lián)系。
　　 近年來,我們和其他學(xué)者研究了Cdk5/p35對(duì)神經(jīng)疼痛信號(hào)傳遞的調(diào)節(jié)作用。2006年,有學(xué)者用p35基因敲除模型p35-/-

7、小鼠及p35過表達(dá)模型Tgp35小鼠,以野生型WT小鼠對(duì)照,發(fā)現(xiàn)Cdk5活性明顯下降的p35-/-小鼠,對(duì)熱刺激引起的疼痛反應(yīng)也明顯延遲；Cdk5水平明顯上調(diào)的Tgp35小鼠,對(duì)熱刺激引起的疼痛出現(xiàn)過敏反應(yīng)。表明了Cdk5/p35參與了疼痛傳遞的調(diào)節(jié)作用。抑制Cdk5的活性已經(jīng)成為治療急、慢性疼痛的新靶點(diǎn)。
　　 綜合以上研究背景,在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了出生后大鼠各發(fā)育階段Vc組織中p39和Cdk5的表達(dá)變化,并且檢測(cè)了Cdk5/p3

8、9活性,通過本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果和以往報(bào)道的出生后大鼠各發(fā)育階段Vc組織中p35和Cdk5表達(dá)變化及Cdk5/p35活性進(jìn)行了比較分析。
　　 目的：
　　 檢測(cè)出生后大鼠各發(fā)育階段Vc組織中p39和Cdk5的表達(dá)及Cdk5的活性變化,通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析比較不同發(fā)育期大鼠Vc內(nèi)Cdk5的活性；分析比較p35和p39在空間和時(shí)間上的表達(dá)特點(diǎn),為今后進(jìn)一步研究在三叉神經(jīng)痛模型中,Cdk5/p35或Cdk5/p39的表達(dá)變化及其意義打下

9、良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),以最終闡明三叉神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)理為最終目的。
　　 材料與方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　 SD雄性大鼠108只按發(fā)育階段分為新生,一周,二周,三周,四周,成體各18只,每個(gè)發(fā)育階段隨機(jī)選取6只做Cdk5的Western bloting檢測(cè)、6只做p39的Western bloting檢測(cè)和6只大鼠做Cdk5免疫沉淀和蛋白活性分析,所有大鼠均由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室以常規(guī)固體飼料飼養(yǎng),自

10、由飲水,濕度40％-50％。
　　 2.標(biāo)本制備
　　 根據(jù)分組標(biāo)志分別稱取大鼠體重,按3ml/Kg體重腹腔注射水合氯醛麻醉后,根據(jù)Paxinos和Watson的大鼠腦立體定位圖譜定好Vc坐標(biāo)位置切取大鼠Vc組織塊,分別放入相應(yīng)標(biāo)記好的試管,放入-80℃冰箱凍存。
　　 3.Vc組織抗原蛋白的提取
　　 按標(biāo)記試管取出組織塊,將其放入勻漿器內(nèi),加入細(xì)胞裂解緩沖液后,將勻漿器置于冰上進(jìn)行徹底勻漿后,將勻漿液

11、移至離心管后,在4℃下,12000rpm離心5min,提取其上清液裝于已經(jīng)標(biāo)志好的離心管中,放入-20℃冰箱保存
　　 4.Vc組織上清液蛋白含量的測(cè)定。
　　 5.根據(jù)測(cè)定的蛋白含量加樣做Cdk5的Western bloting檢測(cè)。
　　 6.根據(jù)測(cè)定的蛋白含量加樣做p39的Western bloting檢測(cè)。
　　 7.根據(jù)測(cè)定的蛋白含量加樣做Cdk5的免疫沉淀和酶活性分析。
　　 結(jié)果：<

12、br>　　 1.Western blot檢測(cè)Cdk5和p39蛋白的表達(dá)
　　 在大鼠出生后各發(fā)育階段Vc組織中,p39表達(dá)變化顯著,p39在新生大鼠的表達(dá)較弱,到一周后有所增加,三周時(shí)表達(dá)最高,這種水平持續(xù)到四周齡,在成體大鼠,p39的表達(dá)水平下降到與新生時(shí)的表達(dá)水平基本相當(dāng),而Cdk5的表達(dá)在整個(gè)發(fā)育階段無明顯的變化。
　　 2.Cdk5蛋白的免疫沉淀和酶活性分析的統(tǒng)計(jì)分析
　　 在大鼠出生后各發(fā)育階段的Vc

13、組織中,Cdk5活性呈現(xiàn)遞減的曲線,在新生的大鼠Vc組織中,Cdk5的表達(dá)活性最高,從出生后的一周、二周、三周、到四周逐漸遞減,在成體大鼠,Cdk5的活性最低。新生大鼠的Cdk5活性約是成體的六倍。
　　 結(jié)論：
　　 (1)在大鼠出生后各發(fā)育階段Vc組織中,Cdk5的表達(dá)和Cdk5的活性變化無顯著關(guān)系；
　　 (2)在大鼠出生后各發(fā)育階段Vc組織中,p35和p39的表達(dá)有顯著差異。p35表達(dá)在新出生、一周、二周