低氧誘導(dǎo)因子-1α在后處理保護(hù)高膽固醇血癥大鼠缺血心肌中的作用.pdf

1、研究背景：心肌缺血后盡早對(duì)缺血區(qū)進(jìn)行血液再灌注是阻止心肌細(xì)胞死亡的唯一有效途徑，然而，再灌注本身會(huì)加重并擴(kuò)大缺血后心肌細(xì)胞損傷，即發(fā)生再灌注損傷。高膽固醇血癥(hypercholesterolemiahyperlipemia,HC)及其隨后發(fā)生的動(dòng)脈粥樣硬化，是臨床最常見的導(dǎo)致心肌缺血的因素之一，流行病學(xué)研究結(jié)果表明，HC并發(fā)心肌缺血患者治療過程中再灌注損傷程度明顯高于無HC心肌缺血患者，提示HC提高了心肌細(xì)胞對(duì)缺血/再灌注損傷的易感性

2、。因此，減輕HC患者心肌缺血/再灌注損傷，最大限度地保護(hù)缺血心肌，是治療缺血性心臟病的關(guān)鍵。
　　 目的：⑴觀察后處理對(duì)高膽固醇血癥大鼠心肌組織缺血/再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)；⑵觀察HIF-1α在高膽固醇血癥大鼠缺血/再灌注心肌中的表達(dá)和后處理時(shí)HIF-1α表達(dá)的變化，探討HIF-1α是否參與后處理的心肌保護(hù)效應(yīng)；⑶給予培養(yǎng)心肌細(xì)胞高膽固醇處理，通過制備缺氧/復(fù)氧及缺氧后處理模型，利用RNAi技術(shù)觀察HIF-1α在后處理對(duì)高膽固醇環(huán)

3、境下心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)效應(yīng)中的作用。
　　 方法：①選取健康Wistar大鼠50只，建立動(dòng)物模型；②心肌梗死面積測(cè)定：采用Evans blue和TTC雙染法，正常的心肌組織被染成藍(lán)色，缺血但未梗死的心肌組織被染為紅色，梗死的心肌組織為白色。圖像分析測(cè)定各區(qū)域面積：危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR/LV，％)=(危險(xiǎn)區(qū)總面積/左心室面積)×100％；心梗面積(An/AAR，％)=(梗死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)總面積)×100％；③測(cè)定血清肌酸激酶

4、(CK)的活性來反映心肌損傷情況；④分別采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)和Caspase-3活性測(cè)定法檢測(cè)大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生情況；⑤用Western-blot法檢測(cè)大鼠心肌組織中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平；⑥用real-time PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織中HIF-1αmRNA的表達(dá)水平；⑦檢測(cè)心肌細(xì)胞膜的流動(dòng)性變化來反應(yīng)高膽固醇細(xì)胞造模是否成功，細(xì)胞存活率(CCK8法)，培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶(LDH)活性變化以及Caspa

5、se-3活性來反映缺氧/復(fù)氧及缺氧后處理對(duì)心肌細(xì)胞的影響；⑧用Western-blot法檢測(cè)大鼠心肌組織中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平；⑨用real-time PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織中HIF-1αmRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：⑴由于大鼠的高膽固醇血癥不會(huì)進(jìn)展為動(dòng)脈粥樣硬化，從而避免了動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)隨后進(jìn)行的缺血后處理研究的影響，因此本研究采用大鼠來建立食源性高膽固醇血癥模型。⑵以危險(xiǎn)區(qū)面積占左心室面積的百分比(即AAR/LV

6、比值)作為判別心肌缺血程度的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組間的AAR/LV均無顯著差異(P＞0.05)，表明各組動(dòng)物模型的缺血程度大體相同，因而在此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突A(chǔ)之上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性。⑶經(jīng)CK試劑盒檢測(cè)可見，高膽固醇血癥缺血/再灌注組與高膽固醇Sham組相比，血清CK活性明顯增高(0.68±0.15 U/mlvs.0.19±0.05U/ml，P＜0.05)，而后處理可以降低缺血/再灌注的血清CK活性(0.48±0.11 U/mlvs.0.68±0

7、.15 U/ml，P＜0.05)。⑷用DNA原位末端缺口標(biāo)記法(TUNEL)進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)，結(jié)果顯示：高膽固醇偽手術(shù)組(HC+Sham)大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)為(1.96±0.23)％，缺血/再灌注組(HC+MI/R)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(15.21±2.47)％明顯增高，而后處理(HC+MI/R+PC)與之相比明顯降低(9.26±0.94)％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。⑸與單純?nèi)毖?再灌注組相比，給予后處理后高膽固醇血癥大鼠心

8、肌組織中HIF-1α蛋白含量顯著增加，而給予DMOG后再給予后處理，則更進(jìn)一步提高了心肌組織HIF-1α的蛋白水平(7.04±0.27vs.2.29.±0.32，P＜0.05)。⑹與普通H9c2(2-1)相比，高膽固醇H9c2(2-1)細(xì)胞膜DPH熒光偏振度(P)和微粘度(η)明顯升高(P：0.34±0.07vs.0.24±0.05，P＜0.01；η：7.99±1.37vs.2.41±0.59，P＜0.01)，說明高膽固醇H9c2(2-

9、1)細(xì)胞膜流動(dòng)性下降。⑺與單純?nèi)毖?復(fù)氧組相比，給予后處理后高膽固醇H9c2(2-1)細(xì)胞中HIF-1α蛋白含量顯著增加，而給予DMOG后再給予后處理，則更進(jìn)一步提高了HIF-1α的蛋白水平(6.94±0.70vs.2.11.±0.40，P＜0.05)。⑻在后處理之前預(yù)先給予使HIF-1α基因沉默，在使HIF-1α的表達(dá)降低的同時(shí)，后處理對(duì)缺氧細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)也下降。由此進(jìn)一步提示，高膽固醇H9c2(2-1)細(xì)胞中HIF-1α的蛋白水平可