表觀遺傳調(diào)控對(duì)胰島β細(xì)胞發(fā)育和功能以及糖尿病發(fā)病的影響和機(jī)制.pdf

1、背景:糖尿病是一種以血糖升高為特點(diǎn)的慢性代謝性疾病，典型的癥狀:多尿，多飲，以及多食;因其糖脂代謝紊亂，患并發(fā)癥如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病視網(wǎng)膜病變、慢性糖尿病腎病以及糖尿病足等的風(fēng)險(xiǎn)極大地增加。糖尿病的病因?yàn)橐葝uβ細(xì)胞不能產(chǎn)生足量的胰島素、組織細(xì)胞對(duì)胰島素失去正常的反應(yīng)或者是二者皆有。目前認(rèn)為糖尿病是由基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，但糖尿病發(fā)病的病因仍然未知。糖尿病主要有Ⅰ型和Ⅱ型兩種。Ⅰ型糖尿病與自身免疫攻擊破壞和先天易感因素導(dǎo)致β細(xì)胞

2、的丟失，胰島β細(xì)胞的缺乏導(dǎo)致產(chǎn)生的胰島素量不足為主要特點(diǎn)。在這一過(guò)程中，許多基因與其發(fā)生有關(guān)，因此探尋糖尿病相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制對(duì)于發(fā)現(xiàn)治療糖尿病的辦法有重大意義。
　　 表觀遺傳是在不改變DNA序列的情況下改變基因的表達(dá)水平。目前發(fā)現(xiàn)有如下幾種表觀遺傳分子機(jī)制:DNA甲基化，RNA干擾，組蛋白乙?；徒M蛋白修飾。小分子RNA是長(zhǎng)度為21-25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它能通過(guò)目標(biāo)信使RNA3'非翻譯區(qū)錯(cuò)配來(lái)抑制目的基因信使

3、RNA的翻譯從而調(diào)控基因的表達(dá)。小分子RNA有組織特異性并能在細(xì)胞功能中起重要作用。目前已有幾種小分子RNA被證明會(huì)特異性調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的發(fā)育和功能。組蛋白通過(guò)和DNA結(jié)合形成核小體，后者組成包含整個(gè)基因組的染色質(zhì)。組蛋白去乙酰酶(HDACs)能使組蛋白去乙?；蛊浜虳NA的結(jié)合更加緊密，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而在包括胰島素信號(hào)傳遞等多個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。HDACs抑制劑也被證實(shí)可以在炎癥過(guò)程中防止細(xì)胞因子對(duì)β細(xì)胞的破壞。但是目前

4、HDACs以及HDACs抑制劑對(duì)β細(xì)胞的直接作用及作用機(jī)制仍然未知。本研究從體內(nèi)體外兩部分實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證HDAC抑制劑曲古霉素A(TSA)對(duì)β細(xì)胞的直接作用以及miRNA表達(dá)的變化，構(gòu)建不同miRNA敲除老鼠觀察其對(duì)鏈尿佐菌素(STZ)誘發(fā)的糖尿病的敏感度，構(gòu)建HDAC3胰島β細(xì)胞特異敲除的老鼠研究HDAC3對(duì)胰島β細(xì)胞發(fā)育以及功能的影響。希望從中明確HDAC與胰島細(xì)胞以及糖尿病發(fā)生的關(guān)系，為開(kāi)發(fā)糖尿病治療藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　

5、研究方法:
　　 1，本研究首先采取不同劑量TSA處理小鼠β細(xì)胞株mouse insulinoma(MIN6)不同時(shí)間，通過(guò)MTT檢測(cè)和流式細(xì)胞儀來(lái)觀察細(xì)胞增殖和凋亡的變化，應(yīng)用micreRNA array技術(shù)確定TSA誘導(dǎo)的β細(xì)胞micreRNA表達(dá)譜的變化，預(yù)測(cè)改變的micreRNAs和β細(xì)胞凋亡信號(hào)因子調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　 2，構(gòu)建miRNA155系統(tǒng)性敲除以及Tie2-Dicerfl/fl特異性敲除的小鼠，觀察它們對(duì)

6、多次小劑量STZ誘導(dǎo)糖尿病的敏感度，進(jìn)而明確miRNA155，以及總miRNA在骨髓源細(xì)胞的缺失在炎癥介導(dǎo)糖尿病中的作用。
　　 3，為明確HDAC3對(duì)β細(xì)胞發(fā)生發(fā)育和功能的作用，構(gòu)建胰島β細(xì)胞特異敲除HDAC3的小鼠，監(jiān)測(cè)小鼠體重血糖水平的變化，通過(guò)糖耐量實(shí)驗(yàn)和葡萄糖刺激的胰島素分泌來(lái)檢測(cè)小鼠胰島功能，利用組織學(xué)分析和免疫熒光染色來(lái)確定其胰島體積變化和胰島β細(xì)胞的增殖狀態(tài)，多次小劑量STZ注射觀察他們對(duì)炎癥介導(dǎo)糖尿病的敏感度。

7、通過(guò)體外的siRNA敲除HDAC3，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胰島素相關(guān)基因以及HDAC3潛在靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)為HDAC3可能的作用靶點(diǎn)，通過(guò)雙敲除HDAC3和SOCS3驗(yàn)證相關(guān)基因表達(dá)以及對(duì)胰島素含量和釋放的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1，TSA對(duì)MIN6細(xì)胞活性有明顯的抑制作用，且有明顯的時(shí)間劑量效應(yīng)關(guān)系，TAS能顯著提高M(jìn)IN6細(xì)胞凋亡水平，分別有61和56個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)

8、和上調(diào)(|-△△Ct|≥1)，其中12個(gè)上調(diào)的和25個(gè)下調(diào)的miRNA可以特異調(diào)控β細(xì)胞凋亡通路的信號(hào)因子。
　　 2，miRNA155系統(tǒng)性敲除的小鼠在多次小劑量STZ誘導(dǎo)的糖尿病中發(fā)病率和野生型小鼠沒(méi)有明顯區(qū)別，但是骨髓源細(xì)胞特異Dicer敲除小鼠卻呈現(xiàn)出了明顯的低發(fā)病率。
　　 3，胰島β細(xì)胞特異性敲除HDAC3小鼠體重較同窩對(duì)照小鼠比體重明顯降低，血糖值明顯升高，且有一定早期自發(fā)糖尿病概率，糖耐量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其葡萄

9、糖不耐受且有胰島素分泌障礙，組織學(xué)證明其胰島體積并未明顯減少，但是其胰腺胰島素含量以及其處于增生狀態(tài)的β細(xì)胞比例都顯著降低，多次小劑量STZ誘導(dǎo)的糖尿病發(fā)病率遠(yuǎn)高于對(duì)照組小鼠。體外通過(guò)siRNA敲除HDAC3使MIN6細(xì)胞胰島素基因轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，通過(guò)篩查控制胰島素合成和分泌以及β細(xì)胞增生發(fā)育的相關(guān)基因，SOCS3被認(rèn)為是潛在靶點(diǎn)，CHIP證明了HDAC3和SOCS3啟動(dòng)子的結(jié)合，通過(guò)HDAC3和SOCS3雙敲除證明了SOCS3可以或

10、者是部分的改善HDAC3敲除對(duì)β細(xì)胞胰島素合成分泌的抑制作用。
　　 結(jié)論:
　　 1，HDAC抑制劑對(duì)胰島β細(xì)胞有明顯生長(zhǎng)抑制和促凋亡作用，伴隨著多種miRNAs表達(dá)的變化，TSA很可能通過(guò)miRNA的參與介導(dǎo)了β細(xì)胞的凋亡過(guò)程，作為目前一種有前途的抗癌藥物，TSA對(duì)β細(xì)胞的負(fù)面作用不可忽視，
　　 2，MiRNA155敲除小鼠雖然在別的自身免疫疾病上表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用，但是卻不能降低多次小劑量STZ誘導(dǎo)的糖

11、尿病發(fā)生率，說(shuō)明miRNA在不同的組織和器官炎癥活動(dòng)中有不同作用，骨髓源性細(xì)胞通過(guò)敲除Dicer導(dǎo)致的miRNA缺失會(huì)降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病發(fā)生率，說(shuō)明了miRNA對(duì)參與胰島炎癥活動(dòng)的免疫細(xì)胞功能必不可少的調(diào)節(jié)作用。
　　 3，HDAC3敲除會(huì)影響β細(xì)胞的發(fā)育和功能，而且不同于HDACs抑制劑會(huì)降低細(xì)胞因子介導(dǎo)的胰島炎癥反應(yīng)，HDAC3的敲除會(huì)增加STZ誘導(dǎo)的糖尿病發(fā)病率，體外實(shí)驗(yàn)也證明了HDAC3沉默會(huì)降低胰島素基因的轉(zhuǎn)錄水平