農(nóng)藥氟蟲腈作用下斑馬魚microRNA-155對(duì)cyb561d2的調(diào)控作用研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)為20～24nt的單鏈非編碼小分子RNA，主要存在于真核生物中，具有組織特異性、無開放閱讀框等特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，并與炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。環(huán)境毒理學(xué)研究表明，當(dāng)生物細(xì)胞或組織暴露于環(huán)境化學(xué)物質(zhì)時(shí)，會(huì)引起相關(guān)miRNA的表達(dá)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致其靶基因表達(dá)發(fā)生變化。因此，有必要明確環(huán)境化學(xué)物質(zhì)、miRNA及其靶基因三者間的作用關(guān)系。在環(huán)境毒理學(xué)

2、研究和環(huán)境監(jiān)測(cè)中，miRNA可作為識(shí)別環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)基因毒性和致癌性的生物標(biāo)記物，并可用于預(yù)測(cè)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對(duì)生物體的毒性。
　　課題組使用基因芯片方法研究了三唑磷微乳劑、氟蟲腈微乳劑及兩者的混合物對(duì)斑馬魚（Daniorerio）miRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示219條待測(cè)miRNA中，21條miRNA表達(dá)發(fā)生了變化，其中氟蟲腈作用可導(dǎo)致斑馬魚miR-155的顯著下調(diào)。在本研究中，我們通過生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)cyb561d2為miR-

3、155的一條潛在靶基因，而cyb561d2是細(xì)胞色素b561的家族成員，主要功能為跨膜電子傳遞、抗環(huán)血酸的再生和平衡并參與細(xì)胞防御以及應(yīng)答環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的刺激。
　　我們將斑馬魚暴露于不同濃度的氟蟲腈中，通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，隨著氟蟲腈處理濃度從0.015mg/L提高到0.480mg/L，斑馬魚miR-155表達(dá)量持續(xù)下調(diào)，從0.96下調(diào)至0.24，而cyb561d2表達(dá)量則從1.94倍升高至4.17倍;采用Westernblot

4、檢測(cè)cyb561d2蛋白表達(dá)量，隨著氟蟲腈處理濃度從0.015mg/L提高到0.480mg/L，其表達(dá)量從1.46倍升高至3.45倍。
　　為驗(yàn)證信息學(xué)手段的預(yù)測(cè)結(jié)果，并解釋氟蟲腈處理的共表達(dá)變化，我們成功構(gòu)建四種重組海腎熒光素酶載體;1）包含全長(zhǎng)3’-UTR序列;2）僅包含miR-155推定結(jié)合位點(diǎn)及其鄰近核苷酸序列;3）包含3個(gè)首尾串聯(lián)的miR-155推定結(jié)合位點(diǎn)序列;4）包含敲除miR-155推定結(jié)合位點(diǎn)的3’-UTR序列，

5、并分別與pGL3-control、miR-155mimic共轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證了斑馬魚cyb561d2的3’-UTR存在miR-155直接結(jié)合位點(diǎn)，為miR-155的靶基因。
　　為明確斑馬魚miR-155對(duì)cyb561d2基因以及cyb561d2蛋白的負(fù)向調(diào)控作用，我們通過轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-155mimic及可以抑制內(nèi)源性miR-155表達(dá)的miR-155inhibitor，引起斑馬魚胚胎細(xì)胞

6、ZF4內(nèi)miR-155的異位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-155mimic的實(shí)驗(yàn)組，cyb561d2mRNA的表達(dá)水平僅為陰性對(duì)照組的0.29，其蛋白表達(dá)水平為陰性對(duì)照組的0.61，均顯著下調(diào);而轉(zhuǎn)染miR-155inhibotor的實(shí)驗(yàn)組，其cyb561d2mRNA的表達(dá)水平則是對(duì)照組的7.71倍，其蛋白表達(dá)水平為陰性對(duì)照組的2.78倍，均顯著上調(diào)。
　　為明確斑馬魚miR-155對(duì)氟蟲腈作用下ZF4細(xì)胞增殖的影響，我們使用MTT法測(cè)定

7、了斑馬魚ZF4細(xì)胞氟蟲腈暴露的IC50值為17.1mg/L，并研究了異位表達(dá)的miR-155對(duì)處于IC50氟蟲腈濃度暴露下的斑馬魚細(xì)胞的增殖及存活率的影響，發(fā)現(xiàn)miR-155顯著降低了ZF4細(xì)胞的增殖及存活率，而抑制內(nèi)源miR-155的表達(dá)，則可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞的增殖及存活率。因此，miR-155可作為暴露于氟蟲腈環(huán)境的生物標(biāo)志物。
　　考慮到miRNA與其靶基因不是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，我們通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到斑馬魚cyb561d2