miR-125b靶向調(diào)控野生型p53在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病中的機(jī)制研究.pdf

1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、醫(yī)療進(jìn)步和教育水平明顯提高，世界人口老齡化問(wèn)題日趨嚴(yán)重。WHO資料預(yù)計(jì)，到2025年全世界60歲以上老齡人口總數(shù)將超過(guò)12億。白內(nèi)障作為一種常見(jiàn)的衰老相關(guān)疾病，發(fā)病率迅速上升，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)60歲以上老人中，96％可以發(fā)現(xiàn)晶狀體有不同程度或不同形式的混濁[1]。據(jù)專(zhuān)家預(yù)測(cè)，到2025年全世界將有4000萬(wàn)人因白內(nèi)障而失明，白內(nèi)障嚴(yán)重?fù)p害患者視力，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，必將造成衛(wèi)生資源和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的沉重負(fù)擔(dān)。因此，白內(nèi)障

2、已成為世界人口老齡化所面臨的最嚴(yán)峻問(wèn)題之一。
　　目前手術(shù)仍然是治療白內(nèi)障最有效的方法，但我國(guó)存在白內(nèi)障患者數(shù)量龐大、患者對(duì)手術(shù)存在一定的恐懼心理、眼科醫(yī)療資源分布不均勻，以及白內(nèi)障手術(shù)后調(diào)節(jié)能力重建、后發(fā)性白內(nèi)障等問(wèn)題。更嚴(yán)峻的是，白內(nèi)障手術(shù)治療的巨大醫(yī)療支出問(wèn)題。因此，揭示白內(nèi)障發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探索一種經(jīng)濟(jì)有效且容易推廣的非手術(shù)防治新途徑，是應(yīng)對(duì)我國(guó)人口老齡化的重要舉措，不僅具有重要的學(xué)術(shù)意義，而且具有潛在的應(yīng)用前景和廣泛的社

3、會(huì)效益。
　　一直以來(lái)，白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制不明確已成為其非手術(shù)治療研究的瓶頸，以往有關(guān)白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究，唯一達(dá)成共識(shí)的是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是非先天性白內(nèi)障形成的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[2]，但具體機(jī)制尚不明確。近年來(lái)有關(guān)microRNA的研究為我們開(kāi)拓了新思路。
　　微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一組全長(zhǎng)大約21-25個(gè)核苷酸的單鏈小分子RNA，存在于植物和動(dòng)物體的細(xì)胞中[3]。microRNA主要是通過(guò)與mR

4、NA的3'非翻譯區(qū)序列完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，引起靶mRNA的降解或翻譯的抑制[4]。據(jù)估計(jì)，在人類(lèi)整個(gè)基因組中，有1/3的基因被microRNA調(diào)節(jié)[5]，目前已發(fā)現(xiàn)有大約一千種microRNA在人類(lèi)基因組中表達(dá)。
　　microRNA與多種疾病包括眼部疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。在慢性丙型肝炎、肝癌、血脂異常等疾病中，microRNA在治療領(lǐng)域的研究已取得突破性進(jìn)展，并相繼在nature，science，cell等期刊中

5、發(fā)表文獻(xiàn)報(bào)道[9-11]。最新研究證明microRNA在白內(nèi)障的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12,13]。Hughe[12]等研究發(fā)現(xiàn)miR-184的seedregion突變可以導(dǎo)致前極性白內(nèi)障，Peng[13]等研究發(fā)現(xiàn)let-7b與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡有顯著關(guān)系等。
　　miR-125，是一種從線蟲(chóng)到人類(lèi)不同物種中高度保守的microRNA，被報(bào)道作為抑制物或促進(jìn)物，與各種類(lèi)型的癌癥和其他疾病密切相關(guān)[14]。mi

6、R-125在細(xì)胞分化、增殖、凋亡等許多不同的細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些作用是通過(guò)靶向調(diào)控不同的轉(zhuǎn)錄因子[15]、基質(zhì)金屬蛋白酶[16,17]、生長(zhǎng)因子[18]以及其他可能導(dǎo)致異常增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、甚至癌癥的變異。此外, miR-125還在宿主的免疫防御，特別是細(xì)菌或病毒感染時(shí)的應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。
　　然而，目前國(guó)內(nèi)外microRNA在眼科領(lǐng)域的研究才剛剛起步，且多限于表達(dá)檢測(cè)，對(duì)microRNA靶基因的預(yù)測(cè)及功能驗(yàn)

7、證研究甚少。其中，miR-125b在眼部疾病，特別是包括白內(nèi)障在內(nèi)的晶狀體疾病中的研究，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)明確報(bào)道。本研究第一次發(fā)現(xiàn)了miR-125b在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中的重要作用，并進(jìn)一步探索了miR-125b通過(guò)調(diào)控靶基因野生型p53從而影響人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　材料與方法:
　　一、組織標(biāo)本
　　收集年齡相關(guān)性白內(nèi)障（排除其他眼部疾病）晶狀體前囊膜的新鮮組織，標(biāo)本來(lái)源于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科2

8、012年9月至2013年6月期間行超聲乳化白內(nèi)障吸出術(shù)時(shí)收集撕囊的晶狀體前囊膜，患者簽署知情同意書(shū)。收集正常人晶狀體前囊膜標(biāo)本，標(biāo)本來(lái)源于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科眼庫(kù)提供意外死亡的新鮮人眼透明晶狀體組織。組織標(biāo)本收集均通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)赫爾辛基宣言的原則進(jìn)行。
　　二、紫外線照射
　　利用紫外燈XX-15B（Spectroline，Westbury, NY, USA）進(jìn)行照射，紫外線光譜在280-320nm之間，

9、峰值為312 nm。利用UVX-31傳感器(both UVP Inc.，SanGabriel，CA，USA)測(cè)量紫外線輻射強(qiáng)度和劑量(校準(zhǔn)波長(zhǎng)312nm)。
　　三、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)
　　按照操作說(shuō)明利用Trizol試劑提取新鮮組織和細(xì)胞系中的總RNA(Invitrogen，NY, USA)。RNA的質(zhì)量利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1800)檢測(cè)。RNA的完整性利用1.5％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。所有樣品

10、OD260/OD280在1.8和2.0之間。
　　按照操作說(shuō)明利用RT引物和TaqMan探針(Ribobio，Guangzhou，China)在ABI7500(Applied Biosystems，USA)中運(yùn)行檢測(cè)miR-125b的表達(dá)，RNU6B作為內(nèi)參對(duì)照。利用PrimerScript RT reagent kit(Takara，Dalian，China)合成cDNA，按照操作說(shuō)明利用染料法在ABI7500(Applied

11、Biosystems，USA)中運(yùn)行檢測(cè)p53的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。循環(huán)結(jié)束后作出溶解曲線保證產(chǎn)物的特異性，經(jīng)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)利用公式RQ=2-△△Ct的方法進(jìn)行分析。
　　四、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
　　人晶狀體上皮細(xì)胞系(SRA01/04)由遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。SRA01/04細(xì)胞利用DMEM培養(yǎng)基（Gibco(@) Invitrogen，Carlsbad, USA），含有10％新生牛血清，100u

12、/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。
　　按照操作說(shuō)明利用Lipofectamine2000(Invitrogen，USA)作為轉(zhuǎn)染試劑，向細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125b mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control(RiboBio,Guangzhou，China)，向細(xì)胞轉(zhuǎn)染p53 siRNA和陰性對(duì)照（GenePharma，Shangha

13、i，China)。48小時(shí)后，利用RT-qPCR方法檢測(cè)miR-125b的表達(dá)，利用RT-qPCR和Western blot方法檢測(cè)p53的表達(dá)，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　五、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率
　　利用Annexin V-EGFP凋亡試劑盒(KenGEN,China)處理實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，避光室溫孵育15分鐘后，利用流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，CA，USA)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每個(gè)處理進(jìn)行3次獨(dú)

14、立實(shí)驗(yàn)。
　　六、Western blot檢測(cè)
　　按照操作說(shuō)明利用SDS-PAGE電泳以及PVDF轉(zhuǎn)印技術(shù)分離不同分子量的蛋白。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃過(guò)夜孵育，二抗室溫孵育2h，GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。Western Lightning(⑩)-ECL，Enhanced Chemiluminescence Substrate(PerkinElmer，NEL100001EA)檢測(cè)，顯影。UVP圖像處理系統(tǒng)采集圖像，Im

15、ageJ灰度分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析(National institutes of Health, Md, USA)。每個(gè)處理進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
　　七、報(bào)告基因構(gòu)建及檢測(cè)
　　以cDNA文庫(kù)為模板，擴(kuò)增得到含有miR-125b預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的p53-3'-UTR序列，連接到pmiR-RB-REPORTTM載體（Ribobio，Guangzhou，China）中構(gòu)建pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR。利用基因

16、定點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建含有突變靶位點(diǎn)的熒光報(bào)告質(zhì)粒pmiR-RB-REPORTTM-mut-p53-3'-UTR。按照操作說(shuō)明利用Lipofectamine2000(Invitrogen，USA)作為轉(zhuǎn)染試劑，向SRA01/04細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR/pmiR-RB-REPORTTM-mut-p53-3'-UTR與miR-125b mimic/mimic control。48小時(shí)后，利用Dual-L

17、uciferase報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(Promega，Madison，WI，USA)檢測(cè)熒光素酶活性。Renilla熒光素酶質(zhì)粒作為內(nèi)參對(duì)照，每個(gè)處理進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
　　八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)(independent samples T-test)進(jìn)行分析。p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　一、miR-125b與

18、野生型p53在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中的表達(dá)
　　利用RT-qPCR和Western blot方法檢測(cè)miR-125b和野生型p53在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜的新鮮樣品與正常人晶狀體前囊膜標(biāo)本中的表達(dá)情況。與對(duì)照組相比，年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜組miR-125b的表達(dá)顯著降低(p＜0.001)，野生型p53的表達(dá)顯著升高(p＜0.001)。結(jié)果表明，在組織樣本中miR-125b與野生型p53的表達(dá)呈反向趨勢(shì)?？紤]到mi

19、croRNA通過(guò)與靶基因mRNA互補(bǔ)結(jié)合從而抑制靶基因表達(dá)的作用方式，p53可能為miR-125b的靶基因。
　　二、miR-125b在人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型中的表達(dá)
　　利用RT-qPCR方法檢測(cè)miR-125b在人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型與正常人晶狀體上皮細(xì)胞系（SRA01/04）中的表達(dá)情況。與對(duì)照組相比，人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型組miR-125b的表達(dá)顯著降低(p＜0.001)。
　　三、轉(zhuǎn)染效率評(píng)定
　

20、　為保證細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的效果，我們分別向SRA01/04細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-125b mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的評(píng)定。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞，利用RT-qPCR方法檢測(cè)各組miR-125b的含量。轉(zhuǎn)染miR-125b mimic組miR-125b的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(p＜0.001)，而轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor組miR-125b的表達(dá)顯著低于對(duì)照

21、組(p＜0.001)，證明轉(zhuǎn)染有效可以進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　四、miR-125b對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響
　　前述結(jié)果中，miR-125b在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織和人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型中表達(dá)顯著降低，提示miR-125b可能與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。我們?cè)谌司铙w上皮細(xì)胞凋亡模型中調(diào)節(jié)miR-125b的表達(dá)，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的改變。轉(zhuǎn)染miR-125b mimic組細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組(p＜0.001

22、)，而轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(p＜0.001)。
　　五、miR-125b靶基因的預(yù)測(cè)
　　為探討miR-125b潛在的靶基因，使用3種靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan5.2，Diana-micro T和miRanda預(yù)測(cè)靶基因。在眾多預(yù)測(cè)的靶基因中，被3種預(yù)測(cè)軟件同時(shí)預(yù)測(cè)到與miR-125b有3個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)的野生型P53，在DNA損傷調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用，因此我

23、們推測(cè)miR-125b可能通過(guò)調(diào)控野生型p53進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。
　　六、miR-125b調(diào)控靶基因p53
　　為證實(shí)p53是否為miR-125b的靶基因，我們向人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型轉(zhuǎn)染miR-125b mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，利用RT-qPCR方法檢測(cè)p53 mRNA水平的表達(dá)情況，利用Western blot方法檢測(cè)p53蛋白水平

24、的表達(dá)情況。在轉(zhuǎn)染miR-125b mimic組，p53的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平均顯著降低(p＜0.001)，而轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor組，p53的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平均顯著升高(p＜0.001)。
　　為進(jìn)一步證實(shí)p53是否為miR-125b直接調(diào)控的下游靶基因，我們利用Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證miR-125b是否通過(guò)p53的3'UTR的靶位點(diǎn)對(duì)其表達(dá)進(jìn)行負(fù)向調(diào)控。向 SR

25、A01/04細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR和miR-125b mimic，mimic control，共轉(zhuǎn)染pmiR-RB-REPORTTM-mut-p53-3'-UTR和miR-125b mimic，mimic control。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR和miR-125b mimic組熒光素酶活性顯著降低(p＜

26、0.001)，而共轉(zhuǎn)染pmiR-RB-REPORTM-mut-p53-3'-UTR和miR-125b mimic組熒光素酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。結(jié)果表明，miR-125b通過(guò)預(yù)測(cè)的3'UTR的結(jié)合位點(diǎn)與p53直接結(jié)合。
　　七、miR-125b通過(guò)抑制靶基因p53調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡
　　miR-125b抑制人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，抑制p53的表達(dá)。為證實(shí)miR-125b是否通過(guò)抑制p53表達(dá)抑制人晶狀體上皮細(xì)

27、胞凋亡，我們利用siRNA在SRA01/04細(xì)胞中干擾了p53的表達(dá)。Western blot驗(yàn)證干擾效率(p＜0.001)。結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor與p53 siRNA組miR-125b對(duì)細(xì)胞凋亡的影響被阻斷，表明miR-125b通過(guò)直接抑制靶基因p53的表達(dá)對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控。
　　結(jié)論:
　　1.miR-125b在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中低表達(dá)。
　　2.人晶狀體上皮細(xì)胞

28、中miR-125b表達(dá)升高時(shí)，細(xì)胞凋亡減少;而細(xì)胞中miR-125b表達(dá)降低時(shí)，細(xì)胞凋亡增加。
　　3.野生型p53是miR-125b的直接靶基因，miR-125b抑制p53的表達(dá)，miR-125b與p53的表達(dá)呈反向趨勢(shì)。
　　4.miR-125b通過(guò)直接抑制靶基因p53的表達(dá)調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。5.miR-125b在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能成為白內(nèi)障診斷和治療中一種新的生物學(xué)標(biāo)記或藥物新靶點(diǎn)。