尼羅羅非魚Oct4的表達、多能性活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、細(xì)胞多能性調(diào)控機制的起源與進化是干細(xì)胞生物學(xué)研究的基本問題。大量研究證實，轉(zhuǎn)錄因子Oct4(octamer-binding transcription factor-4)（又稱為Pou5f1）是哺乳類胚胎內(nèi)細(xì)胞團及體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells。ESCs）多能性維持的關(guān)鍵因子，同時在原始生殖細(xì)胞（PGC）的存活及精原細(xì)胞、卵細(xì)胞的發(fā)育過程中具有重要作用。如Oct4缺失小鼠胚胎發(fā)育至囊胚期，胚胎內(nèi)無內(nèi)細(xì)胞團的

2、形成，只存在大量的滋養(yǎng)層細(xì)胞，并于著床前死亡；條件性敲除Oct4導(dǎo)致原始生殖細(xì)胞（PGC）的凋亡；Oct4與Sox2、Klf4和cMyc共轉(zhuǎn)染已分化細(xì)胞，可使其重編程，轉(zhuǎn)化成多能性干細(xì)胞，即誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞（iPS），從而證實 Oct4在哺乳類細(xì)胞多能性的維持及誘導(dǎo)中具有不可或缺的地位與作用。哺乳類Oct4同源物是否存在于魚類，如是，其是否具有哺乳類類似的多能性表達及其活性，值得研究。
　　已有研究顯示，斑馬魚、青鳉均存在哺乳類

3、Oct4直系同源物，分別被稱為pou2及oct4。有趣的是，斑馬魚Pou2、青鳉Oct4的表達模式及生物學(xué)活性與哺乳類均存在一定差異。比如，與哺乳類 Oct4不同，斑馬魚 Pou2表達于早期胚胎發(fā)育時期的神經(jīng)板及腦組織，不表達于PGC，并且pou2缺失胚胎具有內(nèi)細(xì)胞團，并可發(fā)育至原腸期，將其轉(zhuǎn)染Oct4缺失的小鼠ESCs不能使其恢復(fù)干性，而青鳉Oct4除表達于腦組織與哺乳類不同外，其余均與哺乳類相似。斑馬魚Pou2、青鳉Oct4的表達模

4、式及活性差異在魚類是特例還是普遍存在，目前尚不清楚。羅非魚隸屬于鱸形目(Perciformes)鱺魚科(Cichlidae)，是世界范圍內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類，然而，迄今尚未見其多能性因子Oct4的相關(guān)報道。鑒于此，本研究主要通過免疫組化、基因敲降、細(xì)胞培養(yǎng)、啟動子活性分析等方法，對羅非魚（在本研究中，如未特殊說明，研究用的羅非魚均指尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）Oct4的表達模式、多能性活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行了

5、初步研究，具體如下：
　　1 Oct4表達模式及多能性活性
　　1.1 mRNA水平表達模式
　　RT-PCR檢測6月齡羅非魚不同組織及胚胎發(fā)育不同時期oct4的表達，結(jié)果顯示，oct4在卵巢中高表達，在精巢中低表達，在其他組織中未見表達，同時在胚胎發(fā)育的早期階段，即從受精后的6 h至36 h均有表達，48 h和52 h其表達量降低，72 h后幾乎檢測不到表達。
　　1.2蛋白水平表達模式
　　免疫組化結(jié)果

6、顯示，Oct4表達于胚胎發(fā)育的不同時期，并呈現(xiàn)動態(tài)變化模式，即在受精后第0.5 h（1細(xì)胞期）和8 h（囊胚期）均檢測到Oct4的表達，第18 h（原腸期）、45 h（體節(jié)分化期）幾乎未見表達，第50 h在腦組織部位檢測到表達，第52 h其表達區(qū)域其強度變大，第60 h達到最大，第72 h未見表達；在出膜后5 d的雌魚、雄魚性腺組織的原始生殖細(xì)胞（PGCs）、成魚卵巢各時相的卵細(xì)胞及精巢的精原細(xì)胞均可檢測到Oct4的表達。
　　1

7、.3多能性活性
　　通過顯微注射抑制羅非魚 oct4 mRNA翻譯的Mooct（oct4 mRNA antisense morpholino，）及5個堿基突變的Momoct（5-base mismatch morpholino），以檢測羅非魚Oct4在胚胎發(fā)育及胚胎干細(xì)胞多能性維持中的作用，結(jié)果顯示，注射Mooct的胚胎發(fā)育遲緩，85％左右不能發(fā)育至原腸期便死亡，而對照組90%以上胚胎成活，并能正常發(fā)育；取注射了Mooct與Mom

8、oct囊胚期的細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示，Mooct注射組不能形成胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞，并于第2-3天內(nèi)死亡，而Momoct注射組在分離后24 h即可見細(xì)胞貼壁生長，第2-3天細(xì)胞繼續(xù)增殖，并呈胚胎干細(xì)胞樣形態(tài)。上述結(jié)果表明，羅非魚Oct4對于其早期胚胎發(fā)育及胚胎干細(xì)胞的多能性維持具有重要作用。
　　2羅非魚Oct4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　2.1 Oct4啟動子區(qū)序列
　　從羅非魚基因組成功分離克隆了oct4翻譯起始位點上游308

9、4 bp的啟動子區(qū)序列，并構(gòu)建其綠色熒光報告載體pT2AL-Oroct4-EGFP及不同長度的啟動子熒光素酶表達載體，分別命名為 pOr-3056luc-reporter、pOr-1306luc-reporter、pOr-726luc-reporter和pOr-219luc-reporter。
　　2.2啟動子活性檢測
　　用pT2AL-Oroct4-EGFP顯微注射羅非魚、青鳉受精卵，結(jié)果顯示，在囊胚期胚胎均觀察到明顯綠色

10、熒光；用pT2AL-Oroct4-EGFP分別轉(zhuǎn)染羅非魚胚胎干細(xì)胞（TES3）、青鳉胚胎干細(xì)胞（MES1）和南方鯰的卵巢顆粒細(xì)胞（SCO1），結(jié)果顯示，在TES3和MES1胚胎干細(xì)胞中均能觀察到明顯的綠色熒光信號，而在分化細(xì)胞SCO1未觀察到信號。從而表明，oct4翻譯起始位點上游3084 bp的啟動子區(qū)序列在體內(nèi)外均具有啟動子活性，并且與細(xì)胞多能性狀態(tài)密切相關(guān)，提示其可用于細(xì)胞多能性的監(jiān)測。
　　2.3不同長度oct4啟動子區(qū)熒

11、光素酶表達載體的活性檢測
　　用 pOr-3056luc-reporter、 pOr-1306luc-reporter、 pOr-726luc-reporter和pOr-219luc-reporter轉(zhuǎn)染MES1細(xì)胞，通過檢測熒光強度定量檢測啟動子區(qū)的活性大小，結(jié)果顯示。pOr-726luc-reporter活性最強，其次為pOr-1306luc-reporter，表明在啟動子區(qū)序列726-219 bp之間存在正向調(diào)控元件，而30

12、56-1306及1306-726 bp之間存在負(fù)向調(diào)控元件。
　　2.2 Sox2和Oct4的正向調(diào)控
　　用羅非魚 sox2和 oct4的真核表達載體 pcDNA3.1-sox2與 pcDNA3.1-oct4與pOr-1306luc-reporter共轉(zhuǎn)染MES1，結(jié)果顯示，Sox2與Oct4可明顯增強熒光素酶活性的大小，并且呈濃度依賴，表明Sox2和Oct4可正向調(diào)控Oct4的表達。
　　2.3 RA的負(fù)向調(diào)控

13、r>　　分別用10 nM、100 nM RA（視黃酸，具有促進細(xì)胞分化的作用）處理MES1細(xì)胞5 d后，pOr-1306luc-reporter轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對照組相比，RA誘導(dǎo)細(xì)胞其熒光素酶活性明顯降低，其中100 nM RA誘導(dǎo)細(xì)胞其熒光素酶活性最低。從而表明，RA可負(fù)向調(diào)控Oct4的表達。
　　該研究一方面闡明了羅非魚Oct4與青鳉具有相似的表達模式，并且在早期胚胎發(fā)育及胚胎干細(xì)胞多能性維持方面具有重要作用，從而提示