Toll樣受體4在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核源性巨噬細(xì)胞上的表達(dá)以及在其產(chǎn)生白介素6上的作用.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，免疫細(xì)胞的功能紊亂及免疫因子的網(wǎng)絡(luò)失衡在狼瘡的病理過(guò)程中起重要的作用。經(jīng)檢測(cè)SLE患者外周血和病理組織中有多種免疫因子表達(dá)水平異常，其中白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）在SLE中占有重要的一席。IL-6是一個(gè)多效的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中具有廣泛的生物學(xué)活性?？梢詫?dǎo)致B淋巴細(xì)胞分化為抗體形成細(xì)胞，并促使T細(xì)胞成為效應(yīng)細(xì)胞。IL-6具有很多強(qiáng)大的促炎癥效應(yīng)。在

2、狼瘡鼠的模型中，阻斷IL-6可以改善各種模型鼠的病情。最近的數(shù)據(jù)表明IL-6在B細(xì)胞的高度活化和人類狼瘡的免疫病理和組織損傷中具有重要的作用。SLE患者外周血中IL-6自發(fā)性水平升高，其機(jī)制尚不明確。 細(xì)菌，尤其是格蘭氏陰性菌以及病毒感染是狼瘡誘發(fā)和加重過(guò)程中的重要因素。但是，是否感染是確切的SLE誘發(fā)因素以及感染是如何誘發(fā)SLE患者發(fā)生免疫紊亂的，目前尚有爭(zhēng)議。哺乳動(dòng)物感知外來(lái)微生物的入侵主要是依靠模式識(shí)別受體（pattern

3、 recognized receptors,PRRs），其中最重要的PRRs就是Toll樣受體（toll like receptors,TLRs）。Toll樣受體4（TLR4）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的識(shí)別格蘭氏陰性菌產(chǎn)物脂多糖（lipopolysaccbaride，LPS）的一種主要蛋白，是橋接機(jī)體天然抗感染反應(yīng)及適應(yīng)性免疫的一種重要的分子。本研究的目的是：1.評(píng)價(jià)人外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞的TLR4的表達(dá)情況，探討感染和SLE的關(guān)系。2.初

4、步研究TLR4在感染引起機(jī)體免疫反應(yīng)中的作用和信號(hào)傳導(dǎo)，提出在細(xì)胞水平阻斷感染引起狼瘡異常免疫反應(yīng)的可能性，并為控制狼瘡的病理提供可能的治療靶點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)一 TLR4介導(dǎo)LPS對(duì)于外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞的激活 目的:探討TLR4在LPS激活巨噬細(xì)胞中的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 方法:分離正常外周血中單核細(xì)胞，體外培養(yǎng)成巨噬細(xì)胞，分為3組：1.培養(yǎng)基組。2.LPS組，細(xì)胞培養(yǎng)30min后加入終濃度10ng

5、/ml 的LPS培養(yǎng)過(guò)夜。3.培養(yǎng)基+ LPS+TLR4阻斷劑。細(xì)胞加入終濃度分別為5μg/mL, 20μg /mL, 30μg /Ml的TLR4阻斷劑孵育30min, 120min后中止反應(yīng)，再加入10ng/ml 的LPS培養(yǎng)過(guò)夜。所得細(xì)胞分別檢測(cè)NF-κB的活性變化，并在上述分組細(xì)胞培養(yǎng)8h后收集上清液，ELISA法測(cè)IL-6濃度。 結(jié)果:培養(yǎng)基組、LPS+培養(yǎng)基組、LPS+培養(yǎng)基+TLR4阻斷劑(終濃度分別為和5μg/mL

6、, 20μg /mL, 30μg /mL)組NF-κB相對(duì)活性分別為27.7±3.3，76.6±11.1,65.1±7.6；28.1±4.9,24.7±2.9。培養(yǎng)基組、LPS+培養(yǎng)基組、LPS+培養(yǎng)基+TLR4阻斷劑組(終濃度分別為5μg /mL,20μg /mL, 30μg /mL)組IL-6水平: 48.08±11.2, 2234.71±63.5, 887.09±24.8,348.54±20.1, 299.43±19.9，組間兩兩

7、比較差異有顯著性(P<0.05或P<0.01). 結(jié)論:TLR4介導(dǎo)LPS對(duì)于外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞的激活。最終激活NF-κB。TLR4的激活可以導(dǎo)致血清IL-6水平的升高，TLR4在感染引起IL-6的升高，并發(fā)揮其免疫效應(yīng)中起關(guān)鍵的作用。 實(shí)驗(yàn)二 SLE患者外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞TLR4 mRNA變化及其意義 目的: 探討SLE患者外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞TLR4變化規(guī)律及意義，為感染

8、與SLE發(fā)病的聯(lián)系尋找進(jìn)一步的理論依據(jù)。 方法: 選取SLE病人17例。清晨空腹抽取外周靜脈血10ml，分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)及進(jìn)一步分離單核細(xì)胞，與上個(gè)實(shí)驗(yàn)相同的條件體外培養(yǎng)成巨噬細(xì)胞。同樣分為培養(yǎng)基組和LPS+培養(yǎng)基組。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)化；ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-6的濃度變化。 結(jié)果:與正常組比較，SLE外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞TLR4的表達(dá)上調(diào)，IL-6的濃度升高（P<

9、0.05）。且在LPS的刺激下，SLE外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞的TLR4 mRNA和IL-6也均升高。 結(jié)論: SLE外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞的TLR4介導(dǎo)SLE的炎癥反應(yīng)，其表達(dá)數(shù)量與機(jī)體免疫狀態(tài)有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)三 TLR4阻斷劑對(duì)SLE外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞炎癥水平的影響 目的:驗(yàn)證阻斷TLR4受體是否可以顯著降低SLE外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞的NF-κB的活性和IL-6的產(chǎn)生，從而減

10、輕SLE異常的炎癥反應(yīng)。 方法:24孔培養(yǎng)板中加入體外培養(yǎng)的SLE外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞(2×105/孔，400μl)，分別加入等體積培養(yǎng)基、TLR4阻斷劑(終濃度分別為和5μg /mL, 20μg /mL, 30μg /mL)孵育，120min后中止反應(yīng)，檢測(cè)NF-κB的活性變化和IL-6的水平變化。 結(jié)果: NF-κB的相對(duì)活性分別為30.1±7.9；27.1±4.1,25.2±2.8，22.8±2.4。各組之

11、間NF-κB的相對(duì)活性沒(méi)有顯著性變化，P>0.05。IL-6的水平分別66.11±12.2, 42.18±10.2，31.08±7.2，25.32±6.4。TLR4抗體可以顯著降低SLE外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞IL-6的產(chǎn)生，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，兩兩比較P<0.05。 結(jié)論:TLR4阻斷劑可以顯著影響SLE外周血單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞分泌IL-6，IL-6的產(chǎn)生的主要是TLR4依賴性的；而TLR4阻斷劑并不能顯著抑制SLE