單引物PCR擴增效率及甘藍型油菜Toc33基因啟動子的分離.pdf

1、單引物PCR是一種只用一條引物就可以克隆已知序列側翼未知區(qū)域的染色體步移方法。它利用引物在低嚴謹條件下會與模板發(fā)生錯配結合的特性，使一端引物與已知序列退火，而另一端引物則與未知側翼區(qū)的部分相似序列退火來實現完整的PCR擴增。為了研究引物的長短對擴增效率的影響，分別設計了三組長為6、8、10堿基的短引物以及一組19和22堿基的長引物，以甘藍型油菜基因組DNA為模板進行單引物PCR擴增，用電泳檢測擴增產物并割膠回收較明亮的條帶，再用巢式PC

2、R鑒定擴增產物和回收產物。電泳結果顯示，通過低嚴謹擴增、兩步法擴增或者高嚴謹擴增，長引物的擴增產物大多能獲得清晰明亮的帶型但都不含目的序列；6個或8個堿基的引物其擴增產物彌散或者根本檢測不到：10條10堿基引物中的8條可以產生比較清晰、帶型豐富的擴增產物，而7條引物的擴增產物經鑒定呈陽性，擴增產物的總體陽性率達70％；從擴增產物中一共回收了34條DNA片段，鑒定呈陽性的有17條，回收DNA的平均陽性率為50％。當進行兩輪單引物PCR擴增

3、時，25種擴增產物中有20種鑒定呈陽性，擴增產物的總體陽性率提高到80％。因此，本實驗中的長引物(19、22堿基)不適合單引物PCR；在較短的引物中，6、8堿基引物不適用于單引物PCR，而10堿基單引物PCR則是一種可行性較高的染色體步移策略。 啟動子是基因表達調控的重要順式作用元件，為了了解葉綠體上的外膜蛋白轉運器構件蛋白基因Toc33的轉錄調控機制，以甘藍型油菜基因組DNA作為模板，從設計的一組10堿基引物中選取C3和C4進

4、行兩輪單引物PCR擴增，在C3的首輪和第二輪擴增產物中分別克隆到長為1400 bp和613 bp的兩條目的片段。同源性比對的結果表明，大片段3’端491bp為Toc33基因的部分編碼區(qū)，而5’端909bp則為該基因的側翼序列；小片段3'端497bp為Toc33-like基因的部分編碼區(qū)，而5'端116bp則為該基因的側翼序列。Toc33基因的5'側翼區(qū)共含有5個TATA盒、6個CAAT盒、1個G盒、4個GATA盒、1個I盒、9個GT1C