肛瘺膏治療小兒肛瘺的臨床與細(xì)胞生物學(xué)研究.pdf

1、1研究目的小兒肛瘺是小兒科常見的肛腸疾病，其病因和治療與成人肛瘺不盡相同。盡管某些小兒肛瘺有自愈傾向，但在臨床治療中，由于護(hù)理不當(dāng)?shù)仍颍资共∏榉磸?fù)或加重。導(dǎo)師在臨床中應(yīng)用祛風(fēng)除濕化瘀法治療小兒肛瘺已經(jīng)初步取得良好的療效。本研究擬進(jìn)一步系統(tǒng)觀察肛瘺膏治療小兒肛瘺的臨床療效，深入研究瘺管反復(fù)發(fā)作不能愈合及祛風(fēng)除濕化瘀為治則的肛瘺膏治愈小兒肛瘺的細(xì)胞生物學(xué)作用機(jī)理，為臨床治療本病提供更確切的方法。 2研究方法和內(nèi)容2.1臨床研究采

2、用隨機(jī)、對(duì)照的方法選擇38例小兒肛瘺患者分為治療組與對(duì)照組各19例。治療組選用肛瘺膏，對(duì)照組選用馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏，記錄患者的發(fā)病病因、病程、疾病分型、體溫、內(nèi)口位置及數(shù)量、采用3級(jí)評(píng)分法評(píng)定患者臨床癥狀、體征、指診、舌苔、脈象或察指紋情況；治療后癥狀、體征、指診、肛管局部分泌物pH值的變化、不良反應(yīng)及隨訪情況。 2.2實(shí)驗(yàn)研究(1)實(shí)驗(yàn)一：選擇手術(shù)剔除的一完整小兒肛瘺瘺管組織，采用組織細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞并進(jìn)行純化

3、、傳代。觀察成纖維細(xì)胞一般生物學(xué)特性、繪制成纖維細(xì)胞生長曲線、成纖維細(xì)胞HE染色觀察并采用免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞起源鑒定。對(duì)照組取直腸下段黏膜、黏膜下層組織標(biāo)本進(jìn)行體外成纖維細(xì)胞培養(yǎng)觀察。 (2)實(shí)驗(yàn)二：選用體外培養(yǎng)的肛瘺瘺管組織成纖維細(xì)胞，并與PPH術(shù)(痔上黏膜環(huán)形切除吻合術(shù))中取下的直腸下段黏膜及黏膜下層組織進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長期成纖維細(xì)胞做對(duì)照，分別加入用藥物血清學(xué)方法制備的不同濃度全方藥物血清、祛風(fēng)除濕拆方及活血化瘀

4、拆方藥物血清。觀察各組成纖維細(xì)胞生物學(xué)性狀的改變。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測用藥前后細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況。 (3)實(shí)驗(yàn)三：將原代培養(yǎng)的肛瘺瘺管組織細(xì)胞進(jìn)行酶消化法純化培養(yǎng)獲得上皮細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞起源鑒定。取培養(yǎng)的上皮細(xì)胞分別加入不同濃度全方、祛風(fēng)除濕拆方、活血化瘀拆方水溶液，藥物干預(yù)后12h、24h，觀察各組上皮細(xì)胞的一般生物學(xué)性狀變化，應(yīng)用間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法聯(lián)合LSCM觀測瘺管上皮細(xì)胞角蛋白分布及含量變化。

5、 (4)實(shí)驗(yàn)四：向?qū)?shù)生長期瘺管成纖維細(xì)胞懸液內(nèi)加入含不同濃度藥物血清的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)6h、12h，取細(xì)胞上清液檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)和一氧化氮(NO)含量。觀察用藥前后巨噬細(xì)胞分泌并釋放TNF-α和NO的變化情況。并取加DMEM培養(yǎng)的細(xì)胞上清液作為正常對(duì)照組進(jìn)行比較。 3研究結(jié)果3.1臨床研究結(jié)果(1)治療3d后，治療組瘺管滲液、疼痛、皮膚局部顏色改變較對(duì)照組有明顯改善(P＜0.05)；治療7d后，治療組各臨

6、床癥狀較對(duì)照組均有明顯改善(P＜0.05)。 (2)用藥后第3天，治療組局部分泌物pH值測定降低，偏中性；對(duì)照組局部分泌物pH值測定偏堿性，兩組pH值測定結(jié)果有顯著性差異(P＜0.05)。 (3)治療組肉芽組織開始生長時(shí)間、內(nèi)口愈合時(shí)間、外口愈合時(shí)間明顯短于對(duì)照組，兩者比較有顯著性差異(P＜0.05)。 (4)治療組痊愈10例(52.63％)，明顯優(yōu)于對(duì)照組3例(15.79％)，兩組具有非常顯著差異(P＜0.01

7、)。治療組總有效率89.47％，優(yōu)于對(duì)照組78.95％，兩組具有顯著差異(P＜0.05)。 (5)治療組用藥后觀察未出現(xiàn)局部不良反應(yīng)。對(duì)照組用藥后1例出現(xiàn)短暫性局部分泌物增多。 (6)隨訪1年，治療組平均復(fù)發(fā)率10.53％，對(duì)照組平均復(fù)發(fā)率21.05％，二者有顯著性差異(P＜0.01)。 3.2實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果3.2.1實(shí)驗(yàn)一研究結(jié)果瘺管組織塊在培養(yǎng)至5～7d，倒置顯微鏡下可見典型的肛瘺瘺管組織成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞

8、潛伏期、對(duì)數(shù)生長期、平臺(tái)期分別為0～1d、2～4d和5～8d；對(duì)照組直腸下段黏膜及黏膜下組織培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞外形與肛瘺瘺管組織成纖維細(xì)胞無明顯差別。瘺管成纖維細(xì)胞蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)波形蛋白鑒定為陽性，角蛋白鑒定為陰性。 3.2.2實(shí)驗(yàn)二研究結(jié)果(1)應(yīng)用不同濃度肛瘺膏及其拆方藥物血清(1～5組)干預(yù)后，見成纖維細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯改變?？瞻讓?duì)照組血清(6組)、胎牛血清組(7組)、肛瘺膏等劑量組對(duì)正常直腸黏膜組織(8

9、組)作用24h后成纖維細(xì)胞增殖明顯。 (2)各藥物血清組在6h、12h、24h各時(shí)相均能抑制成纖維細(xì)胞增殖，其作用與含藥劑量、作用時(shí)間呈正相關(guān)。其中以全方大劑量藥物血清組對(duì)瘺管成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)。 (3)各藥物血清作用24h后，均出現(xiàn)調(diào)亡峰，并隨濃度升高凋亡峰逐漸升高，全方大劑量藥物血清組調(diào)亡峰最為明顯，組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。 (4)不同藥物血清作用24h后，直方圖中均可見G0/G1期峰

10、前的亞二倍體峰，即調(diào)亡峰，1～3組凋亡峰逐漸升高，并均高于4、5組，組間比較有顯著性差異(P＜0.05)，3組調(diào)亡峰最為明顯，1～5各組與6組(對(duì)照組)有顯著性差異(P＜0.01)；8組與6組(對(duì)照組)、7組比較差異不明顯(P＞0.05)；8組與6組相比，細(xì)胞周期分布、進(jìn)入G2/M的細(xì)胞比率無顯著性差異(P＞0.05)。 3.2.3實(shí)驗(yàn)三研究結(jié)果(1)瘺管組織塊在培養(yǎng)至7～9d，可見組織塊周圍有上皮細(xì)胞，其間夾雜有較多成纖維細(xì)胞

11、生長。消化傳代后上皮細(xì)胞為橢圓形單層生長。 (2)藥物干預(yù)后24h內(nèi)，上皮細(xì)胞開始回縮，細(xì)胞變圓，大多數(shù)細(xì)胞與鄰近細(xì)胞接觸消失。 (3)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察上皮細(xì)胞角蛋白均分布于細(xì)胞質(zhì)中，呈綠色熒光，細(xì)胞核呈紅色熒光。 (4)空白對(duì)照組上皮細(xì)胞角蛋白熒光強(qiáng)度較弱(3082.25±79.61)，藥物干預(yù)12h，全方大劑量組角蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)最為明顯(7475.24±123.52)，分布增多，細(xì)胞表面較光滑，細(xì)胞

12、中央為呈紅色熒光的細(xì)胞核，與其它各組比較有顯著性差異(P＜0.05)；各組熒光強(qiáng)度由強(qiáng)至弱依次為全方大劑量組、全方小劑量組、祛風(fēng)除濕拆方大劑量組、活血化瘀拆方大劑量組，空白對(duì)照組，組間比較均有顯著性差異(P＜0.05)；藥物干預(yù)24h后，全方各組角蛋白綠色熒光越來越多，排列緊密，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)明顯，與各拆方組均有顯著性差異(P＜0.05)，大劑量全方組熒光強(qiáng)度(8744.15±238.13)尤為明顯(P＜0.05)。 3.2.4實(shí)

13、驗(yàn)四研究結(jié)果各組藥物血清處理巨噬細(xì)胞與混合細(xì)胞6h后，TNF-α、NO濃度均降低，大劑量組抑制巨噬細(xì)胞TNF-α、NO的產(chǎn)生作用最為顯著，且隨時(shí)間延長(12h)，兩者濃度降低顯著，與空白血清組比較，均有顯著性差異(P＜0.01)，同一時(shí)間、同濃度藥物血清對(duì)巨噬細(xì)胞、混合細(xì)胞釋放TNF-α、NO的影響有顯著性差異(P＜0.05)。 4結(jié)論(1)成纖維細(xì)胞的凋亡障礙可能是肛瘺炎癥后期嚴(yán)重瘢痕形成的重要機(jī)制。 (2)巨噬細(xì)胞過

14、度釋放炎性介質(zhì)是肛瘺炎癥持續(xù)存在關(guān)鍵，肛瘺膏通過調(diào)控巨噬細(xì)胞，減少局部炎性介質(zhì)的過度釋放而起到保護(hù)作用。 (3)肛瘺膏通過雙向調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖治愈小兒肛瘺。在肛瘺早期，肛瘺膏主要是抑制成纖維細(xì)胞增殖，而當(dāng)炎癥消退后，肛瘺膏的主要作用是促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。 (4)肛瘺膏對(duì)上皮細(xì)胞骨架蛋白具有修復(fù)作用。 (5)推測肛瘺膏通過調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖間接調(diào)節(jié)膠原合成及降解達(dá)到平衡狀態(tài)。 (6)肛瘺膏對(duì)于瘺管成纖維