雞羽根角蛋白在體組織工程化神經(jīng)——材料研制及前期實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來(lái)，周?chē)窠?jīng)損傷的發(fā)生率趨于增高，探尋用以修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損并替代自體神經(jīng)移植這一金標(biāo)準(zhǔn)的材料研究倍受關(guān)注。 研究發(fā)現(xiàn)，“神經(jīng)再生小室”為神經(jīng)再生提供了一個(gè)良好的、相對(duì)封閉的微環(huán)境，并能阻滯瘢痕形成。神經(jīng)橋接管較好地解決了這一問(wèn)題。 用來(lái)橋接周?chē)窠?jīng)缺損的材料應(yīng)具備以下條件：①良好的生物相容性：材料及其降解產(chǎn)物對(duì)組織細(xì)胞無(wú)毒、無(wú)“三致”、無(wú)明顯抗原性；②生物可降解性；③良好的表面粘附活性；④足夠的生物力學(xué)性能。

2、 國(guó)內(nèi)外學(xué)者在該領(lǐng)域做了大量研究：從單一材料到復(fù)合材料，從非生物降解吸收材料到生物可降解吸收材料，主要包括天然材料、人工合成材料及復(fù)合材料等。這些材料在神經(jīng)修復(fù)中雖取得了一定效果，但至今仍未有一種應(yīng)用于臨床的、產(chǎn)業(yè)化的神經(jīng)橋接材料。 目前較受關(guān)注的是可降解吸收的天然生物材料和人工合成的高分子聚合材料。天然生物材料，即天然高分子材料或其復(fù)合物，主要指從動(dòng)物結(jié)締組織或皮膚中提取的，經(jīng)特殊化學(xué)處理的，具有活性或特殊性能的蛋白質(zhì)，如膠原

3、、明膠、甲殼素、淀粉、纖維素、透明質(zhì)酸等；人工合成的可降解高分子材料如聚乳酸(PLA)等，具有可標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、可降解、組織相容性好等優(yōu)點(diǎn)。但其酸性降解產(chǎn)物可能對(duì)周?chē)?xì)胞活性產(chǎn)生不利影響，同時(shí)其親水性、細(xì)胞相容性、力學(xué)強(qiáng)度等均尚待改進(jìn)。 最近我們提出“在體/原位組織工程”新概念，即：將可吸收生物支架材料植入體內(nèi)，并通過(guò)材料本身和/或其降解產(chǎn)物活化周?chē)M織的成體干細(xì)胞，利用體內(nèi)微環(huán)境和精確的調(diào)節(jié)機(jī)制在體誘導(dǎo)分化和培養(yǎng)種子細(xì)胞，“原位”

4、構(gòu)建相應(yīng)的組織或器官，從而克服了傳統(tǒng)的體外組織工程化組織或器官構(gòu)建存在的問(wèn)題。我們?cè)O(shè)想以雞羽根為材料構(gòu)建在體組織工程化神經(jīng)，并獲得廣東省自然科學(xué)基金的資助。本研究即為該項(xiàng)目的前期研究。 研究包括：制備可降解吸收的雞羽根角蛋白(CCK)，觀(guān)察雞羽根角蛋白的形態(tài)結(jié)構(gòu)，組織相容性及其毒性，以及生物可降解性，為雞羽根角蛋白橋接缺損神經(jīng)以及之后的產(chǎn)業(yè)化提供數(shù)據(jù)。 第一部分雞羽根角蛋白的制備及形態(tài)學(xué)觀(guān)察 目的 了解雞羽根角蛋

5、白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 方法 1.雞羽根的獲得：健康活體雞羽，取規(guī)格類(lèi)似的羽根。 2.雞羽根角蛋白管的制備：序貫的、可控性理化處理程序。 3.形態(tài)學(xué)觀(guān)察：石蠟切片HE染色、光學(xué)顯微鏡/掃描電鏡術(shù)。 結(jié)果 1.新鮮雞羽根：腔內(nèi)有內(nèi)容物，有一定的水分，較柔韌。 2.未處理雞羽根(干燥后)：質(zhì)硬，不易切斷，淡黃色，半透明，內(nèi)容物呈現(xiàn)薄膜螺旋樣結(jié)構(gòu)，與管腔易分離。 3.處理后雞羽根：質(zhì)柔韌，

6、乳白色，不透明，較易切斷。 4.雞羽根顯微結(jié)構(gòu)：橫斷面，從內(nèi)到外依次分為四個(gè)致密層：①嗜堿性均質(zhì)狀粗線(xiàn)(0.5～1μm寬)；②3～5層的嗜酸性角質(zhì)層；③60～100層含大量色素顆粒的環(huán)行角蛋白束；④10～20層含少量色素顆粒的角蛋白束。處理前、后的雞羽根在光鏡下的結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯區(qū)別。 5.雞羽根掃描電鏡觀(guān)察： 未處理的雞羽根：結(jié)構(gòu)致密，管壁較平整，無(wú)孔洞。 處理后的雞羽根：結(jié)構(gòu)較疏松，角蛋白束橫縱交錯(cuò)，可見(jiàn)

7、大小、深淺不等的孔洞。 結(jié)論 1.未處理雞羽根：天然管腔，由多層角蛋白束構(gòu)成，含色素顆粒和少量基質(zhì)，結(jié)構(gòu)致密，不利于直接用作生物材料。 2.處理后雞羽根：外觀(guān)呈現(xiàn)許多孔洞，結(jié)構(gòu)疏松、角蛋白束交錯(cuò)排列，可能為組織工程備用材料，需進(jìn)一步研究。 第二部分雞羽根角蛋白管毒性作用的觀(guān)察 目的 觀(guān)察雞羽根角蛋白管的毒性作用 方法 1.雞羽根角蛋白管浸提液的制備： 1)雞羽根角蛋白管的制

8、備：采用序貫的、可控性理化程序不同程度(輕、中、重)的處理，制備相應(yīng)的羽根角蛋白管。 2)浸提液制備：將上述3種羽根角蛋白管按每6cm2表面積分別加入9％氯化鈉注射液或MEM培養(yǎng)基lml，37℃下浸泡72h，即得浸提液。 2.浸提液化學(xué)特性：Lowry's法測(cè)定蛋白質(zhì)和肽類(lèi)物質(zhì)總量；紫外吸收法測(cè)定其280nm和254nm處的光吸收及其比值；改良的Γабризлян紫外吸收法測(cè)定中分子肽含量；Ellman法測(cè)定巰基含量。

9、 3.皮膚致敏實(shí)驗(yàn)：將2cm×2cm規(guī)格的濾紙分別浸泡在3種雞羽根角蛋白浸提液(實(shí)驗(yàn)組，n=6)、9％氯化鈉注射液(陰性對(duì)照，n=6)及甲醛溶液(陽(yáng)性對(duì)照，n=6)中浸透后待用。分別貼于SD大鼠背部脫毛皮膚，6h后移去濾紙，24h和48h后觀(guān)察實(shí)驗(yàn)部位的情況。每周重復(fù)一次，連續(xù)3周。 4.皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)：家兔脊柱兩側(cè)皮下分別注射3種雞羽根角蛋白浸提液(實(shí)驗(yàn)組，n=5點(diǎn))、9％氯化鈉注射液(對(duì)照組，n=5點(diǎn))，24h、48h、

10、72h后觀(guān)察局部組織反應(yīng)。 5.小鼠全身急性毒性實(shí)驗(yàn)：昆明小鼠腹腔內(nèi)分別注射(50ml/kg)3種雞羽根角蛋白浸提液(實(shí)驗(yàn)組，n=5)和9％氯化鈉注射液(對(duì)照組，n=5)，4、24、48、72h時(shí)觀(guān)察動(dòng)物的一般狀況、毒性表現(xiàn)和死亡數(shù)。 6.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：在96孔L929細(xì)胞培板內(nèi)分別加入3種雞羽根角蛋白的培養(yǎng)基浸提液(實(shí)驗(yàn)組，n=8)和MEM培養(yǎng)液(對(duì)照組，n=8)，于2，4，6d時(shí)觀(guān)察細(xì)胞情況(MTT法)。 結(jié)

11、果 1.9％氯化鈉注射液為浸提介質(zhì)的浸提液外觀(guān)變化不明顯，MEM培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)的浸提液外觀(guān)上由紅色變?yōu)榉奂t色，pH值波動(dòng)不大。 2.雞羽根浸出液中釋放物質(zhì)主要成份為中等分子量的肽類(lèi)物質(zhì)，大分子蛋白釋放不多。 3.皮膚致敏實(shí)驗(yàn)：皮膚無(wú)紅斑、水腫和壞死。 4.皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)：皮內(nèi)無(wú)紅斑水腫現(xiàn)象。 5.小鼠全身急性毒性實(shí)驗(yàn)：未出現(xiàn)死亡、衰竭、發(fā)紺、震顫、嚴(yán)重的腹部刺激、眼瞼下垂，呼吸困難等毒性、癥狀。

12、 6.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞毒性接近于0級(jí)。 結(jié)論雞羽根角蛋白管可被水解，釋放一些肽類(lèi)物質(zhì)，其浸提液對(duì)皮膚無(wú)致敏作用，皮內(nèi)刺激反應(yīng)弱，不引起全身急性毒性癥狀，無(wú)細(xì)胞毒性。 第三部分雞羽根角蛋白植入后的形態(tài)學(xué)觀(guān)察 目的 觀(guān)察雞羽根角蛋白在活體組織內(nèi)的降解及其對(duì)周?chē)M織的影響 方法 1.SD大鼠背部肌組織內(nèi)分別植入雞羽根角蛋白片(輕、中、重)(實(shí)驗(yàn)組，n=6)和未處理羽根片(對(duì)照組，n=6)，1w、

13、4w、8w、12w時(shí)取材(含周?chē)M織)，常規(guī)組織切片染色，光鏡下形態(tài)學(xué)觀(guān)察； 2.SD大鼠坐骨神經(jīng)束間分別植入雞羽根角蛋白絲(輕、中、重)(實(shí)驗(yàn)組，n=6)和未處理羽根絲(對(duì)照組，n=6)，3w、8w時(shí)取材，常規(guī)組織切片染色，光鏡下形態(tài)學(xué)觀(guān)察，冰凍切片行Nestin免疫組化觀(guān)察。 結(jié)果 1.不論肌組織內(nèi)植入還是神經(jīng)束間植入，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。 2.形態(tài)學(xué)觀(guān)察： 1）肌組織內(nèi)植入：1w包膜形

14、成，分界清，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；4w材料呈條絲狀劈開(kāi)，仍有炎性細(xì)胞；8w材料呈細(xì)絲狀或散在細(xì)顆粒狀，進(jìn)一步降解吸收，仍有少量炎性細(xì)胞，可見(jiàn)多核巨細(xì)胞；12w材料降解顯著，材料被分成細(xì)小的碎片。對(duì)照組各時(shí)間段材料結(jié)構(gòu)完整。 2)神經(jīng)束間植入：3w、8w引起的組織反應(yīng)與細(xì)胞類(lèi)型同肌組織內(nèi)植入，均未完全降解，實(shí)驗(yàn)組材料對(duì)神經(jīng)纖維無(wú)不良影響，而對(duì)照組神經(jīng)纖維出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。Nestin免疫組化未檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果。 結(jié)論 1