可降解材料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)醫(yī)用生物安全性研究.pdf

1、第一部分聚丁二酸丁二醇酯(PBS)的體外細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)
　　 目的:體外細(xì)胞生物學(xué)相容性評(píng)價(jià)是醫(yī)用材料生物相容性評(píng)價(jià)體系中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高和研究周期短等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于材料臨床應(yīng)用前的生物安全性評(píng)價(jià)。本部分采用體外細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，研究聚丁二酸丁二醇酯[poly(butylene succinate)，PBS]的細(xì)胞相容性，并為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:以THP-1細(xì)胞和CHO細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

2、，分別與不同濃度的PBS材料浸提液(0 mg/ml、25 mg/ml、50 mg/ml、100 mg/ml、200 mg/ml)體外共培養(yǎng)48小時(shí)，同時(shí)將細(xì)胞直接種植于材料表面培養(yǎng)24小時(shí)和72小時(shí)，利用相差顯微鏡和掃描電鏡分別觀察細(xì)胞形態(tài)變化和材料表面粘附的細(xì)胞數(shù)量及延展性;通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)分別研究不同濃度的材料浸提液(3.1 mg/ml、6.2 mg/ml、12.5 mg/ml、25 mg/ml、50 mg/ml、100mg/ml、2

3、00mg/ml)對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的毒性;采用EdU方法評(píng)價(jià)最大濃度PBS浸提液(200 mg/ml)共培養(yǎng)后的細(xì)胞相對(duì)增殖率，流式細(xì)胞儀技術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）和Hoechst33342染色方法檢測(cè)最大濃度PBS浸提液共培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后的細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:①各濃度浸提液共培養(yǎng)48小時(shí)后，兩種細(xì)胞相差顯微鏡下形態(tài)正常，增殖旺盛;PBS材料表面粘附的細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，延展性良好，但

4、在培養(yǎng)72小時(shí)后，少數(shù)THP-1細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)三角形或不規(guī)則改變。
　　 ②與最大濃度PBS材料浸提液共培養(yǎng)72小時(shí)后，CHO細(xì)胞和THP-1細(xì)胞的相對(duì)存活率分別為（93.2±2.3）％和（81.2±5.3）％，與相同實(shí)驗(yàn)條件醫(yī)用級(jí)L-PLA浸提液組結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(P＞0.05);且PBS材料浸提液對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均不存在半數(shù)細(xì)胞增殖抑制濃度(50％concentration of inhibition，IC50)。
　　

5、③與最大濃度PBS材料浸提液共培養(yǎng)的CHO細(xì)胞，隨時(shí)間延長(zhǎng)均出現(xiàn)不同程度細(xì)胞凋亡;THP-1細(xì)胞也出現(xiàn)不同程度細(xì)胞凋亡，其中72小時(shí)時(shí)細(xì)胞凋亡率明顯高于24小時(shí)和48小時(shí)，(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)條件下，PBS材料浸提液對(duì)CHO細(xì)胞和THP-1細(xì)胞的形態(tài)、增殖/凋亡影響較小，顯示出良好的體外細(xì)胞相容性;但相同條件下，THP-1細(xì)胞對(duì)該材料具有較強(qiáng)的敏感性。
　　 第二部分聚丁二酸丁二醇酯(PBS)的體外遺傳

6、毒性研究
　　 目的:遺傳毒性評(píng)價(jià)是生物材料長(zhǎng)期臨床應(yīng)用安全的基本保證，主要包括致癌性和致突變性，是材料生物相容性研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容。本部分通過(guò)體外細(xì)胞共培養(yǎng)方法，研究聚丁二酸丁二醇酯[poly（butylene succinate），PBS]的體外遺傳毒性。
　　 方法:在代謝活化系統(tǒng)存在和缺乏條件下，分別檢測(cè)最大濃度(200mg/ml) PBS材料浸提液共培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后CHO細(xì)胞的染色體畸變;以ZnSO4·

7、7H2O的IC25(22ug/ml)劑量作為陽(yáng)性對(duì)照，吖啶橙（Acridine Orange，AO）染色研究最大濃度PBS材料浸提液對(duì)CHO細(xì)胞的微核形成影響。以實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RealTime Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)和蛋白免疫印跡(Westernblotting，WB)方法分別檢測(cè)PBS材料浸提液共培養(yǎng)后CHO細(xì)胞P53、Survivn基因及蛋白的表達(dá)變化

8、;以RT-qPCR方法檢測(cè)PBS材料浸提液對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bc1-2、Smac和IAP-1的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:①代謝活化系統(tǒng)存在和缺乏條件下，PBS材料浸提液誘發(fā)CHO細(xì)胞的染色體畸變率均小于5％，對(duì)該細(xì)胞無(wú)致突變性。
　　 ②CHO細(xì)胞最大濃度PBS浸提液共培養(yǎng)72小時(shí)后出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù)為（1.62±1.01），與F12/DMEM組和L-PLA組相比均無(wú)差異（P＞0.05），明顯低于ZnSO4

9、·7H2O IC10劑量組(25.45±3.23)，(P＜0.05)。
　　 ③浸提液共培養(yǎng)后CHO細(xì)胞P53、Survivn基因及蛋白表達(dá)與F12/DMEM對(duì)照組相比，均沒(méi)有明顯變化(P＞0.05)。
　　 ④浸提液共培養(yǎng)后THP-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因與RPMI-1640對(duì)照組相比，抗凋亡基因Bc1-2表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，促凋亡基因Bax表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，而IAP-1和Smac基因表達(dá)則無(wú)明顯變化，(P＞0

10、.05)。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)條件下，PBS材料浸提液對(duì)CHO細(xì)胞的染色體行為作用較小，無(wú)致突變性，不影響其癌相關(guān)基因和蛋白表達(dá)變化。該材料浸提液不誘發(fā)THP-1細(xì)胞抗凋亡基因的過(guò)表達(dá)，無(wú)致癌性;促凋亡基因Bax上調(diào)，抗凋亡基因Bc1-2下調(diào)可能是其誘發(fā)該細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　 第三部分聚丁二酸丁二醇酯(PBS)體內(nèi)毒性研究
　　 目的:動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依然是目前評(píng)價(jià)生物材料安全性的重要手段，其結(jié)果更具有科學(xué)性和

11、可信度。本部分以ICR小鼠為研究對(duì)象，以灌胃染毒方法研究聚丁二酸丁二醇酯[poly(butylene succinate)，PBS]的急慢性毒性，以及骨髓染色體畸變和淋巴細(xì)胞微核形成的影響，并進(jìn)一步驗(yàn)證體外評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 方法:將ICR小鼠分為生理鹽水組、L-PLA浸提液組、PBS浸提液組和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組，以小鼠最大灌胃容量染毒7天，通過(guò)小鼠一般情況，組織病理、骨髓染色體畸變和淋巴細(xì)胞微核評(píng)價(jià)PBS材料的體內(nèi)毒性。<

12、br>　　 結(jié)果:染毒期間PBS材料浸提液組小鼠一般情況良好，重要臟器無(wú)病理變化;其染色體畸變率為（4.4±1.6）％，與生理鹽水組和L-PLA浸提液組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05); PBS浸提液組小鼠淋巴細(xì)胞的微核細(xì)胞數(shù)為（5.52±4.01），與生理鹽水組和L-PLA組相比無(wú)差異(P＞0.05)，明顯低于環(huán)磷酰胺對(duì)照組(31.84±5.37)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論;本實(shí)驗(yàn)條件下，PBS材料對(duì)ICR沒(méi)有毒性和致突