RNAi靶向肝癌細胞hTERT后H2AX和DNMT3b基因表達的變化.pdf

1、目的:為進一步研究hTERT的新的生物學功能,探索肝癌基因治療的新途徑與新方法,本研究采用RNA干擾技術,以SMMC-7721細胞為研究對象,將hTERT mRNA為作用靶標,在體外細胞水平下調hTERT的表達后,觀察肝癌細胞一般生物學特性的改變以及抑癌基因H2AX和甲基化轉移酶hDNMT3b表達的改變。
　　方法:利用PCR技術克隆U6啟動子,構建RNAi表達空載體pGFP-U。將hTERT cDNA序列(AGACCAAGCAC

2、TTCCTCTACT,AF015950:980-1000bp)及其反向重復序列以9bp連接序列連接后再加上RNA聚合酶Ⅲ的終止序列(TTTTTT),將此段DNA序列克隆至pGFP-U載體的U6啟動子下游,構建重組載體pGFP-shTERT,該目的載體可以在體內表達靶向hTERT的短發(fā)卡RNA。將重組質粒與對照質粒pGFP-U分別轉染SMMC-7721細胞。轉染48h后,倒置熒光顯微鏡下進行觀察,并以G418篩選抗性轉染細胞。以MTT實驗

3、測定SMMC-7721細胞的生長速度;以TRIzol試劑分別提取各組細胞總RNA,并以各組總RNA為模板進行兩步法逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR),檢測分析hTERT、H2AX、DNMT3b基因的表達。
　　結果:RNAi空載體pGFP-U和RNAi重組載體pGFP-shTERT經酶切、測序驗證。在兩組轉染細胞中均能觀察到綠色熒光蛋白的高效表達。與轉染對照質粒pGFP-U的SMMC-7721細胞相比,轉染表達shRNA重組質粒的

4、細胞其hTERT基因表達水平顯著下降,細胞生長速度變慢,H2AX基因表達水平顯著提高,而DNMT3b沒有明顯改變。
　　結論:1.成功構建RNAi空載體pGFP-U和靶向hTERT的重組載體pGFP-shTERT,并獲得穩(wěn)定表達靶向hTERT的shRNA的SMMC-7721肝癌細胞株。
　　2.SMMC-7721細胞hTERT下調后,明顯抑制細胞的增殖能力。同時,hTERT可與H2AX發(fā)生作用,對H2AX的表達有一定調節(jié)作用