持續(xù)驚厥后新生神經(jīng)細(xì)胞的增殖狀況及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對其電生理特征的影響.pdf

1、目的：探討驚厥持續(xù)狀態(tài)（status convulsion，SC）后未成熟大鼠腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的動態(tài)變化。 方法：建立幼年Wistar鼠3h SC模型，在SC后0天至40天的7個時間點上處死動物，處死前1天腹腔注射5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo2-deoxyuridine，BrdU）；采用免疫組化方法動態(tài)檢測海馬、胼胝體下區(qū)（subcallosalzone，SCZ）和皮層在各時間點BrdU的表達(dá)，確定SC后各時間點上腦內(nèi)不

2、同區(qū)域神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的增殖水平和遷移趨勢。 結(jié)果：（1）正常未成熟腦海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）的顆粒細(xì)胞下層（subgranularzone，SGZ）和胼胝體下區(qū)（subcallosalzone，SCZ）以及皮層都存在少量BrdU陽性細(xì)胞；與對照組相比，SC后0天海馬DG的SGZ，海馬CA1、CA3區(qū)，SCZ以及皮層BrdU陽性細(xì)胞即開始顯著升高，海馬的SGZ、CA

3、1、CA3以及皮層于.SC后2天出現(xiàn)增殖高峰，SCZ于SC后7天出現(xiàn)增殖高峰。（2）SC后2天DG分子層出現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞，SC后7天DG門區(qū)出現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞。SGZ新生細(xì)胞有向DG分子層遷移趨勢，SCZ細(xì)胞有向CA1、CA3和皮層遷移趨勢。 結(jié)論：SC刺激未成熟腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生，部分新生細(xì)胞發(fā)生異位遷移，部分細(xì)胞可能向海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷區(qū)遷移。 目的：觀察體外分離培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell

4、s，NSCs）分化前后鈉、鉀離子通道的表達(dá)。 方法：無血清培養(yǎng)體外分離、純化孕15-16天Wistar胎鼠的海馬NSCs，nestin免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞是否為干細(xì)胞，無血清促分化培養(yǎng)基促分化，β-Ⅲ-tubulin、GFAP熒光鑒定分化細(xì)胞類型。顯微注射熒光黃標(biāo)記記錄細(xì)胞，采用β-Ⅲ-tubulin免疫熒光染色檢測所記錄細(xì)胞是否具有神經(jīng)元表型。膜片鉗記錄NSCs分化前和分化后具有神經(jīng)元樣細(xì)胞的電壓門控鈉、鉀離子通道的表達(dá)，

5、 結(jié)果：（1）體外培養(yǎng)的海馬NSCs nestin免疫染色陽性，具有自我增殖能力能在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞；（2）膜片鉗記錄的細(xì)胞均具有神經(jīng)元表型；（3）未分化NSCs無內(nèi)向性鈉電流，分化后1天即可檢測到內(nèi)向性鈉電流；未分化和分化的NSCs均表達(dá)瞬時外向鉀電流和外向延遲整流鉀電流。 結(jié)論：（1）采用無血清培養(yǎng)方法，在體外成功分離海馬NSCs；（2）神經(jīng)發(fā)生過程中鈉通道的功能性表達(dá)可能是NSCs退出細(xì)胞周期開始分化

6、的標(biāo)志。未分化和分化的NSCs表達(dá)兩種類型的外向性鉀離子電流。 目的：探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）對海馬神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem célls，NSCs）被動膜特性和電壓門控鈉、鉀通道電生理特征的影響 方法：采用無血清促分化培養(yǎng)基促NSCs體外分化，選擇體外分化前期（1-4天）和體外分化后期（8-15天）具有神經(jīng)元形態(tài)細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗記錄；記

7、錄細(xì)胞被動膜特性、鈉電流，分析鈉電流密度，擬合鈉通道激活曲線，計算半數(shù)激活電壓和斜率因子。記錄總鉀電流，分離瞬時外向鉀電流和外向延遲整流鉀電流；分析兩種電流在分化前期和后期的表達(dá)情況；分析電流密度，擬合激活曲線，計算半數(shù)激活電壓和斜率因子。 結(jié)果：（1）NSCs分化早期，BDNF促進(jìn)靜息電位左移，膜電容增加，輸入阻抗降低，時間常數(shù)延長。（2）無BDNF干預(yù)，對照組鈉電流密度隨分化逐漸增加；BDNF干預(yù)后，分化前期，BDNF作用組

8、鈉電流密度明顯高于對照組；而分化后期BDNF作用組鈉電流密度明顯低于對照組；BDNF長期作用使鈉電流激活曲線右移。（3）所有記錄的細(xì)胞都表達(dá)IK（DR）；無BDNF干預(yù)，對照組IK（A）的表達(dá)隨著分化逐漸增加；BDNF干預(yù)后，IK（A）的表達(dá)隨著分化逐漸降低；分化前期，BDNF作用組總鉀電流密度較對照組明顯增加；分化后期，兩個實驗組的總鉀電流密度沒有差異；無BDNF干預(yù)，隨著分化對照組IK（A）和IK（DR）半數(shù)激活電壓都發(fā)生左移；分化

9、前期，與對照組相比IK（A）和IK（DR）半數(shù)激活電壓也都發(fā)生左移，分化后期，BDNF作用組與對照組之間沒有差異。 結(jié)論：（1）分化前期為細(xì)胞被動膜特性發(fā)育的關(guān)鍵時期，BDNF在NSCs細(xì)胞形態(tài)改變的同時促進(jìn)NSCs來源的神經(jīng)元樣細(xì)胞被動膜特性發(fā)育，以促進(jìn)NSCs被動膜特性趨向成熟化。（2）體外培養(yǎng)NSCs分化前期（1-4天）也是細(xì)胞鈉、鉀通道發(fā)育的關(guān)鍵時期；（3）BDNF促進(jìn)分化早期鈉通道的表達(dá)和/或開放，而長期作用則抑制鈉通