甲醛和苯乙烯DNA加合特性及生物標(biāo)志物的研究.pdf

1、甲醛(Formaldehyde)是一種常見的、被廣泛應(yīng)用于建筑，裝飾材料和家用化學(xué)品的重要化學(xué)物質(zhì)。常溫下是一種無色，具有強(qiáng)烈刺激性的氣體，易溶于水，其35﹪-40﹪的水溶液通稱為福爾馬林，常作為浸漬標(biāo)本的防腐劑。長(zhǎng)期接觸低濃度甲醛，可引起人體免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及皮膚、肝臟等器官的損害。高濃度甲醛是一種遺傳毒性物質(zhì)，美國職業(yè)衛(wèi)生閾限值中將甲醛列為可疑人類致癌物(2A組)。甲醛具有正電性，是一種化學(xué)性質(zhì)比較活潑的小分子醛類化合物

2、，可以進(jìn)攻親核基團(tuán)而造成大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸的損傷。 苯乙烯(Styrene)是人類可疑致癌物(2B組)，作為制造合成樹脂、合成橡膠、塑料、油漆、藥品和香料等的主要化工原料，用途十分廣泛。苯乙烯主要通過呼吸道吸收，占總吸收量的89﹪，經(jīng)皮膚和胃腸道可少量吸收。長(zhǎng)期接觸低濃度苯乙烯，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟有慢性毒作用，亦可引起血液改變和腎的損害，對(duì)心臟及生殖系統(tǒng)的毒性亦有報(bào)道，屬于中等偏低毒性化合物。 國內(nèi)外對(duì)甲醛和苯乙烯的

3、職業(yè)接觸、在體內(nèi)的吸收、代謝、排泄情況都進(jìn)行了研究，基本搞清了兩者的代謝規(guī)律，但這些研究?jī)H局限在代謝機(jī)理、流行病學(xué)等領(lǐng)域，很少觸及到對(duì)機(jī)體的損傷情況，生物監(jiān)測(cè)方面也缺乏系統(tǒng)性，而且外部因素如飲酒、吸煙對(duì)生物監(jiān)測(cè)的影響也難以定量消除。 隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，生物標(biāo)志物(Biomaker)的研究作為一個(gè)嶄新的領(lǐng)域逐漸引起了國內(nèi)外預(yù)防醫(yī)學(xué)界的共同關(guān)注。生物標(biāo)志物所反映的是生物體系與環(huán)境因子(化學(xué)的、物理的或生物學(xué)的)相互

4、作用引起的生理、生化、免疫和遺傳等多方面的分子水平上的改變，是環(huán)境醫(yī)學(xué)發(fā)展到分子水平的重要里程碑，它的研究在分子流行病學(xué)、分子毒理學(xué)、勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域中均具有極其重要的價(jià)值。 DNA加合物是生物有效劑量(到達(dá)劑量或靶劑量)的生物標(biāo)志物，它是毒性化合物進(jìn)入人體后與細(xì)胞DNA相互作用而形成的。DNA加合物被認(rèn)為是化學(xué)致癌、致畸、致突變過程的關(guān)鍵，它一旦逃避了自身修復(fù)就可能成為“三致”作用的最小啟動(dòng)因子。 [研究方法]

5、 1．以高效液相色譜法測(cè)定工作場(chǎng)所空氣中甲醛、苯乙烯及其職業(yè)接觸者尿中代謝產(chǎn)物的濃度依據(jù)《工作場(chǎng)所空氣中毒物檢測(cè)方法的研制規(guī)范》、《生物材料分析方法的研制準(zhǔn)則(尿樣及血樣)》的要求，研究建立工作場(chǎng)所空氣中甲醛的HPLC測(cè)定方法(包括現(xiàn)場(chǎng)采樣方法、HPLC分析方法)、甲醛職業(yè)接觸者尿中代謝產(chǎn)物(甲酸)的HPLC測(cè)定方法、苯乙烯職業(yè)接觸者尿中代謝產(chǎn)物(苯乙烯巰基尿酸、苯乙醇酸、苯乙醛酸)的HPLC測(cè)定方法，為工作場(chǎng)所空氣中甲醛的測(cè)定、

6、甲醛和苯乙烯職業(yè)接觸者的生物監(jiān)測(cè)提供規(guī)范化方法。 2．應(yīng)用體外及體內(nèi)培養(yǎng)、紫外吸收光譜移動(dòng)法篩選、高效液相色譜分析等方法研究甲醛、苯乙烯DNA加合反應(yīng)特性取小牛胸腺DNA(20.0μg／ml)，加入不同濃度的甲醛、苯乙烯及其代謝產(chǎn)物，于37℃恒溫水浴保持24h，用紫外吸收光譜移動(dòng)法篩選可能發(fā)生加合反應(yīng)的化合物。 取四種單脫氧核苷酸在磷酸鹽緩沖液(PH 7.2)中，分別與篩選化合物進(jìn)行反應(yīng)，37℃恒溫下孵育，充N2密封，18h之后

7、進(jìn)高效液相色譜測(cè)定，確定加合反應(yīng)的位點(diǎn)，同時(shí)利用該反應(yīng)體系研究DNA加合物的化學(xué)健型、加合反應(yīng)的反應(yīng)級(jí)數(shù)等。 運(yùn)用ficoll密度梯度離心技術(shù)，從健康成人外周血中分離出淋巴細(xì)胞，用培養(yǎng)液配成一定濃度的細(xì)胞懸液，分別加入不同濃度的篩選化合物染毒、孵育。用試劑盒將染毒的健康成人外周血淋巴細(xì)胞DNA提取出來，經(jīng)蒸餾水稀釋后，應(yīng)用紫外吸收光譜移動(dòng)法證實(shí)甲醛、苯乙烯是否可誘導(dǎo)人淋巴細(xì)胞DNA加合效應(yīng)，從而對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有一定損傷作用。

8、 3．分別以高效液相色譜、PCR-RFLP方法研究甲醛職業(yè)接觸人群接觸生物標(biāo)志物甲酸和易感性生物標(biāo)志物ALDH2、CYP2E1的基因多態(tài)性，探討甲酸作為甲醛暴露監(jiān)測(cè)指標(biāo)的可能性，尋找易感基因用于甲醛高危人群的篩選。 以浸漬2，4-二硝基苯肼的硅膠管采集工作場(chǎng)所空氣中的甲醛，高效液相色譜儀測(cè)定其濃度。 用聚乙烯塑料瓶，采集甲醛接觸者的晨尿或班后尿，加入磷酸鹽緩沖液(PH7.6)和衍生劑卜溴甲基一五氟基苯，60℃水浴保溫

9、1h，正己烷萃取，高效液相色譜儀測(cè)定其中甲酸的濃度。 應(yīng)用HPLC法測(cè)定吸煙者尿中尼古丁、甲酸含量，探討尿中尼古丁含量與甲酸代謝的相關(guān)關(guān)系，從而定量消除吸煙因素對(duì)甲酸測(cè)定的影響。 采集甲醛接觸者的靜脈血樣5 ml(經(jīng)知情同意)，裝入EDTA抗凝管內(nèi)混勻，冷藏保存，ficoll密度梯度離心法提取人外周血淋巴細(xì)胞，飽和苯酚/氯仿抽提法提取全血基因組DNA，PCR-RFLP法檢測(cè)ALDH2、CYP2E1的遺傳多態(tài)性。

10、4.分別以高效液相色譜、PCR-RFLP方法研究苯乙烯職業(yè)接觸人群接觸生物標(biāo)志物苯乙烯巰基尿酸、苯乙醇酸、苯乙醛酸和易感性生物標(biāo)志物CYP2E1、GSTT1、GSTM1、EPHX1的基因多態(tài)性，探討接觸生物標(biāo)志物作為苯乙烯暴露監(jiān)測(cè)指標(biāo)的可能性，尋找易感基因用于苯乙烯高危人群的篩選。 以活性炭管采集苯乙烯接觸者8小時(shí)個(gè)體接觸劑量，高效液相色譜儀測(cè)定其濃度。 用聚乙烯塑料瓶，采集苯乙烯接觸者的晨尿或班后尿，以乙酸乙酯萃取，高

11、效液相色譜儀測(cè)定其中苯乙烯巰基尿酸、苯乙醇酸、苯乙醛酸的濃度。 [研究結(jié)論]1．本項(xiàng)研究建立的“工作場(chǎng)所空氣中甲醛的HPLC測(cè)定方法”，“甲醛職業(yè)接觸者尿中代謝產(chǎn)物的HPLC測(cè)定方法”，“苯乙烯職業(yè)接觸者尿中代謝產(chǎn)物的HPLC測(cè)定方法”，符合《工作場(chǎng)所空氣中毒物檢測(cè)方法的研制規(guī)范》、《生物材料分析方法的研制準(zhǔn)則(尿樣及血樣)》的要求，可用于工作場(chǎng)所空氣中甲醛的測(cè)定、甲醛及苯乙烯職業(yè)接觸者尿中代謝產(chǎn)物的測(cè)定。 2．甲醛中活

12、潑的醛基使得其不需經(jīng)過代謝就能攻擊核酸堿基，一分子甲醛可以通過共價(jià)鍵與一分子dGMP相互結(jié)合，形成穩(wěn)定的加合物，活體細(xì)胞與小牛胸腺DNA的體外加合反應(yīng)一致，提示甲醛具有遺傳毒性效應(yīng)。 苯乙烯則主要通過其活性中間體環(huán)氧苯乙烯攻擊核酸堿基，一分子環(huán)氧苯乙烯可以通過共價(jià)鍵與一分子dGMP結(jié)合，生成穩(wěn)定的加合物?；铙w細(xì)胞與小牛胸腺DNA的體外加合反應(yīng)一致。提示苯乙烯也具有遺傳毒性。 3．晨尿中甲酸增加量可作為甲醛接觸者的生物標(biāo)志

13、物，同時(shí)推薦與現(xiàn)行甲醛的MAC值相配套的甲醛接觸者晨尿中甲酸增加量的生物閾限值為19.7 mg/g肌酐。 通過檢測(cè)尿中尼古丁含量可以算出吸煙導(dǎo)致甲酸增加的量，可用接觸甲醛的吸煙工人尿中甲酸含量減去吸煙導(dǎo)致甲酸增加的量，來排除吸煙對(duì)甲酸生物監(jiān)測(cè)的影響。 CYP2El不影響甲醛的代謝活動(dòng)：ALDH2可作為甲醛易感性生物標(biāo)志物，用于甲醛高危人群的篩選。 4．晨尿中苯乙烯巰基尿酸、苯乙醇酸、苯乙醛酸、(苯乙醇酸+苯乙醛酸

14、)及班后尿中苯乙烯巰基尿酸可作為接觸苯乙烯工人的生物標(biāo)志物，同時(shí)推薦與現(xiàn)行TWA相配套的苯乙烯接觸者晨尿中苯乙烯巰基尿酸、苯乙醇酸、苯乙醛酸、(苯乙醇酸+苯乙醛酸)的生物閾限值為--苯乙烯巰基尿酸：11 mg/g肌酐；苯乙醇酸：607mg/g肌酐；苯乙醛酸：386mg/g肌酐；(苯乙醇酸+苯乙醛酸)：992mg/g肌酐；班后尿中苯乙烯巰基尿酸的生物閾限值為29 mg/g肌酐。 GSTTI不影響苯乙烯的代謝活動(dòng)；CYP2E1、GSTM1和