P38 MAPK和GCR在糖皮質激素調節(jié)星形膠質細胞GnRH表達中的作用.pdf

1、糖皮質激素（Glucocorticoid,GC）是一種類固醇激素，其濃度受到下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamic-pituitary-adrenocoyical axis,HPA）軸的調控，在維持機體的穩(wěn)態(tài)，調節(jié)生殖及免疫等功能中發(fā)揮了重要作用。促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-relesaing horme,GnRH）是一種10肽激素，是繁殖活動最重要的調節(jié)激素，主要通過下丘腦-垂體-性腺（Hypothalami

2、c-pituitary-gonadal,HPG）軸來對生殖活動進行調控。在應激情況下，HPA軸主要通過分泌GC影響HPG軸，從而影響生殖，母畜的生殖能力會通過此種方式而下降。星形膠質細胞在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位，尤其在生殖、免疫、應激等方面。根據(jù)本實驗室已完成的工作中，已經(jīng)在體外證明了星形膠質細胞能夠分泌GnRH，然而其受到哪種信號通路的調節(jié)仍然未知。GC-GCR是糖皮質激素發(fā)揮經(jīng)典基因組效應的系統(tǒng)，P38 MAPK是與免疫相關

3、的最重要信號通路。但其兩者在星形膠質細胞分泌GnRH中發(fā)揮怎樣的作用，未有相關資料報道。因此，在應激情況下星形膠質細胞分泌GnRH會發(fā)生怎樣的變化，星形膠質細胞分泌GnRH會受到怎樣的調節(jié)成為了本實驗的研究重點。
　　本實驗利用體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦星形膠質細胞，探究P38 MAPK和GCR在糖皮質激素調節(jié)星形膠質細胞的GnRH表達中的作用，其中主要研究內(nèi)容如下：
　　（1）不同濃度GC對星形膠質細胞分泌GnRH的影響；

4、>　?。?）GCR在GC刺激星形膠質細胞分泌GnRH中的作用；
　?。?）P38 MAPK信號通路對GC刺激星形膠質細胞分泌GnRH的影響；
　?。?）P38 MAPK下游核轉錄因子NF-κB對GC刺激星形膠質細胞分泌GnRH的影響。
　?。?）為了有效的探究P38 MAPK和GCR在糖皮質激素調節(jié)星形膠質細胞的GnRH表達中的作用，本實驗采用1～3日齡的雌性SD新生大鼠，培養(yǎng)原代星形膠質細胞，經(jīng)過原代培養(yǎng)、純化和傳代

5、培養(yǎng)，獲得所需細胞，經(jīng)星形膠質細胞特異性標記蛋白-膠質纖維酸性蛋白（GFAP）免疫熒光染色檢驗細胞，所得細胞的純化率達99％以上，可進行后續(xù)實驗。
　　（2）為了研究不同濃度GC對星形膠質細胞分泌GnRH的影響，以糖皮質激素類似物地塞米松（DEX）刺激星形膠質細胞，用10-4 mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L的DEX分別處理1 h、12 h、24 h、48 h后，利

6、用ELISA檢測不同濃度GC對星形膠質細胞GnRH的分泌情況、利用實時熒光定量PCR檢測GnRH的mRNA轉錄水平，并利用Western Blot檢測在各濃度GC處理下GCR的變化情況，結果顯示，1 h、12 h、24 h、48 h時10-4 mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L GC處理組的蛋白及mRNA轉錄水平均在不同階段顯著高于對照組（P<0.05），GCR在各時間段中

7、對10-8 mol/L濃度的GC最為敏感，綜合分析確定10-8 mol/L的GC為最佳的實驗處理濃度。
　?。?）為了研究GCR在GC刺激星形膠質細胞分泌GnRH中的作用，通過使用10-8 mol/L DEX-BSA與DEX分別刺激星形膠質細胞，分別設置GC-BSA組、GC組和對照組，用免疫熒光方法檢測GCR的激活情況，并利用ELISA和實時熒光定量PCR方法對各組GnRH分泌量和mRNA轉錄水平的變化進行檢測，結果顯示，GC組在

8、1 h、24 h轉錄水平顯著高于對照組（P<0.05），12 h、24 h的蛋白水平顯著高于對照組證明（P<0.05），而GC-BSA組在各時間段與對照組相比無顯著性差異，證明當GCR激活后能夠促進糖皮質激素刺激星形膠質細胞GnRH的分泌。
　?。?）為了研究P38 MAPK信號通路是否對GC刺激星形膠質細胞分泌GnRH具有調節(jié)作用，通過使用10μmol/L的P38阻斷劑SB203580及10-8 mol/L DEX處理，分別設置

9、P38阻斷劑組、P38阻斷劑+GC組、GC組與對照組，分別處理1 h、12 h、24 h、48 h后，檢測各組GnRH分泌量、mRNA水平的變化及GCR激活情況，結果顯示在12 h、24 h時P38阻斷劑+GC組與GC組的蛋白及轉錄水平均顯著高于對照組（P<0.05），且P38阻斷劑+GC組在mRNA轉錄水平顯著高于GC組（P<0.05），而在48 h時P38阻斷劑+ GC組仍保持較高的分泌水平顯著高于對照組（P<0.05），而P38阻

10、斷劑組的蛋白與轉錄水平在各時間段與對照組無顯著性差異，綜上所述表明，在GCR激活后，阻斷P38 MAPK信號通路對GC刺激星形膠質細胞分泌GnRH具有上調作用。
　?。?）為了研究P38 MAPK對激活下游核轉錄因子NF-κB的影響，通過使用10μmol/L的P38阻斷劑SB203580及10-8 mol/L DEX處理，分別設置P38阻斷劑組、P38阻斷劑+GC組、GC組與對照組，分別處理1 h、12 h、24 h、48 h后，

11、并通過 WesternBlot檢測不同時間NF-κB（P65）磷酸化情況。結果顯示1 h、12 h時GC處理組的磷酸化P65表達量極顯著高于對照組（P<0.01），24 h時顯著高于對照組（P<0.05）；1 h、12 h時P38阻斷劑組、P38阻斷劑+GC組的磷酸化P65表達量極顯著低于對照組（P<0.01），24 h時、P38阻斷劑+GC組顯著低于對照組（P<0.05）；1 h、12 h時P38阻斷劑組與P38阻斷劑+GC組的磷酸化

12、P65表達量無顯著差異（P>0.05）。證明經(jīng)GC處理后的星形膠質細胞的磷酸化P65表達量會增加，在加入P38阻斷劑后的星形膠質細胞磷酸化P65表達量會降低，并且該過程不會受到GC的刺激而增加。綜上可知，P38 MAPK是引起核轉錄因子NF-κB磷酸化的關鍵激酶。
　?。?）為了研究P38 MAPK信號通路下游的NF-κB核轉錄因子是否對GC刺激星形膠質細胞分泌GnRH具有調節(jié)作用，通過使用10μmol/L NF-κB阻斷劑BAY

13、11-7082及10-8 mol/L DEX處理，分別設置NF-κB阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+GC組、GC組與對照組，分別處理1 h、12 h、24 h、48 h后，檢測各組GnRH分泌量、mRNA水平的變化及GCR信號通路激活情況，結果顯示在12 h、24 h時NF-κB阻斷劑+GC組、GC組的蛋白水平顯著高于對照組（P<0.05），而NF-κB阻斷劑+GC組在1 h、12 h、24 h、48 h極顯著高于對照組與GC組（P<0.0

14、1）結果證明，在GCR激活后阻斷P38 MAPK信號通路下游的核轉錄因子NF-κB對GC刺激星形膠質細胞分泌GnRH具有上調作用。
　　綜上所述，該試驗可以得到以下結果：
　　1、糖皮質激素在10-8 mol/L至10-4 mol/L濃度范圍內(nèi)，均能促進星形膠質細胞中分泌GnRH，且糖皮質激素濃度越高這種促進分泌作用時間越長。
　　2、糖皮質激素能夠通過激活GCR促進星形膠質細胞分泌GnRH。
　　3、當GCR激