系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中泌乳素介導(dǎo)的JAK-STAT信號(hào)通路及AG490的干預(yù)研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一種女性多見(jiàn)、臨床表現(xiàn)多樣、可累及全身多臟器的自身免疫性疾病。免疫調(diào)節(jié)異常在SLE的發(fā)病中起主導(dǎo)作用，其中包括許多免疫細(xì)胞的功能異常。近年來(lái)世界范圍內(nèi)報(bào)道SLE的發(fā)病率在（13～39）110萬(wàn)之間，18歲以上女性發(fā)病率高達(dá)372/10萬(wàn)。我國(guó)患病率約為70/10萬(wàn)，且有逐年增多的趨勢(shì)。其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能與遺傳、環(huán)境、性激素等因素有關(guān)。

2、泌乳素（Prolactin，PRL）是一種主要由垂體前葉的嗜酸細(xì)胞分泌的、具有300多種獨(dú)立活性的多肽。它參與了機(jī)體多個(gè)生理和疾病過(guò)程，如炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、滲透壓調(diào)節(jié)等。其經(jīng)典作用是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物乳腺、卵巢及男性附屬生殖器官的生長(zhǎng)和分化過(guò)程，促進(jìn)泌乳。它的具體作用包括：①參與T細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)TH1/TH2平衡向TH1方向偏移；②活化蛋白激酶C和鳥(niǎo)氨酸環(huán)化酶；③具有促有絲分裂原的作用，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的IL-12受體表達(dá)和各種生長(zhǎng)因子相

3、關(guān)基因的表達(dá)；④通過(guò)干擾素調(diào)節(jié)因子促進(jìn)干擾素γ的表達(dá)；⑤刺激自身抗體的產(chǎn)生。 AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈脂類衍生物，相對(duì)分子質(zhì)量為294．3，結(jié)構(gòu)類似酪氨酸，可以和受體酪氨酸激酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位置，而競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)胞內(nèi)JAK的活性，從而抑制其下游的信號(hào)分子STAT5的表達(dá)，進(jìn)而抑制與該通路有關(guān)的各種炎癥因子的產(chǎn)生。本研究擬通過(guò)AG490對(duì)PRL誘導(dǎo)的胞內(nèi)JAK/STAT5信號(hào)通路干預(yù)的研究，進(jìn)一步明確SLE的發(fā)病機(jī)制，以期

4、為SLE的生物治療開(kāi)辟一條新的治療途徑。 目的: 1．檢測(cè)SLE患者血清PRL水平，分析其與SLE疾病活動(dòng)性、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系。 2．研究PRL（內(nèi)源性）及重組人PRL（rhPRL）對(duì)SLE患者PBMC內(nèi)主要信號(hào)蛋白STAT5表達(dá)的影響，探討其參與SLE發(fā)病的機(jī)制。 3．研究PRL及thPRL對(duì)SLE患者PBMC分泌IL-6的影響，從而探討PRL介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路JAK/STAT5與IL-6

5、產(chǎn)生的關(guān)系。 4．通過(guò)AG490對(duì)JAK/STAT5信號(hào)傳導(dǎo)通路的干預(yù)研究，明確SLE中PRL誘導(dǎo)PBMC分泌IL-6的作用機(jī)制，以期為SLE的生物治療開(kāi)辟一條新的治療途徑。 方法: 1．應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)了40例SLE患者（其中女性36例，男性4例）及20例健康人在清晨、空腹及靜息狀態(tài)下的血清PRL水平。取空腹靜脈血3ml，血清泌乳素的檢測(cè)采用電化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定。按試劑盒提供標(biāo)準(zhǔn)，血清PRL水平男性>15．2n

6、g/ml，女性>23．3ng/ml定為HPRL。 2．將樣本分組：40例SLE患者中，HPRL的SLE患者為22例，PRL正常的SLE患者18例，又將其按不同的處理方式各自再分為3組，加上健康對(duì)照組一共為7組。分組如下：①HPRL的SLE患者組（N=22）；②HPRL的SLE患者+AG490組（N=22）；③HPRL的SLE患者+AG490+rhPRL組（N=22）；④正常對(duì)照+rhPRL組（N=20）；⑤正常PRL的SLE患者

7、組（N=18）；⑥正常PRL的SLE患者+rhPRL組（N=18）；⑦正常PRL的SLE患者+rhPRL+AG490組（N=18）。取六孔板，將細(xì)胞和培養(yǎng)液鋪于六孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1×106/ml。thPRL的最終濃度為10ng/ml，AG490的最終濃度為10-6mol/l。 3．PBMC分離、培養(yǎng)：按密度梯度離心法分離外周血中的PBMC，步驟如下： （1）在15ml有刻度無(wú)菌離心管中，每管加入5mlFicol

8、l淋巴細(xì)胞分離液，然后取肝素抗凝的外周靜脈血10ml（包括40例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和20例正常對(duì)照女性）與等量PBS充分混勻稀釋。用巴斯德滴管吸取已稀釋的抗凝血10ml沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液上（每樣本按2管分離），20℃，2000rpm，水平離心20min。（2）用滴管插到灰白色層，吸取單個(gè)核細(xì)胞，置于另一離心管內(nèi)。加入5倍以上體積的PBS，20℃，1500rpm，水平離心10min，洗滌細(xì)胞2次，獲得研究樣品的PBMC。（3）

9、處理后的每組細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后分別進(jìn)行ELISA檢測(cè)和Western blot檢測(cè)。 4．ELISA檢測(cè)：將培養(yǎng)后的細(xì)胞1500rpm，水平離心10min，取上清按IL-6 ELISA試劑盒提供的步驟操作。操作程序總結(jié)如下：①加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)90min。不洗。②加生物素標(biāo)記抗體，37℃反應(yīng)60min。0．01M TBS洗滌3次。③加ABC，37℃反應(yīng)30min。0．01M TBS洗滌5次。④

10、TMB37℃反應(yīng)10-15min。⑤加入TMB終止液，用酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。 5．Western blot檢測(cè)：將離心沉積的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液RIPA20μl及PMSF5ul，置0℃裂解10min后吸入EP管中，超聲粉碎細(xì)胞，4℃離心（1，000×g，30min）。取上清提取總蛋白。待測(cè)樣品采用BCA比色法進(jìn)行蛋白定量。按常規(guī)方法配制10%SDS-PAGE分離膠和5%積層膠。細(xì)胞樣品加入到上樣緩沖

11、液中，在沸水中煮10分鐘。然后每孔加入50μg細(xì)胞蛋白樣品，置電泳緩沖液中，80v電泳約30 min。待樣品進(jìn)入分離膠后，140v電泳至溴酚藍(lán)指示劑離膠底線約1cm時(shí)停止電泳。10v半干式電轉(zhuǎn)膜25min，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。TBST配制的5%脫脂牛奶室溫封閉2小時(shí)后加入一抗1：1000，37℃孵育1小時(shí)或4℃過(guò)夜。洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗1：500，37℃孵育1小時(shí)。洗膜后加發(fā)光劑顯影，定影，洗片。用凝膠成像分析系統(tǒng)

12、進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果以STAT5/β-actin、p-STAT5/β-actin的灰度比值表示。 6．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)輸入SPSS13．0軟件包，兩組樣本均數(shù)之間的比較使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組樣本均數(shù)之間的比較，當(dāng)滿足方差齊性時(shí)，使用單向方差分析和樣本均數(shù)間的多重比較（LSD方法）。當(dāng)不滿足方差齊性時(shí)使用近似F檢驗(yàn)（Welch方法）及校正的多重比較方法（Dunnett's T3）。多個(gè)樣本率的比較使用X2檢驗(yàn)。雙變量間的關(guān)系

13、使用雙變量相關(guān)分析及多變量間的關(guān)系使用曲線估計(jì)。使用Curve Expert1．3繪制擬合曲線并根據(jù)曲線擬合的決定系數(shù)R2選擇最佳曲線擬合方程。以P<0．05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果中數(shù)據(jù)以x±SD表示。 結(jié)果: 1．SLE患者血清平均PRL水平顯著高于正常對(duì)照組（t=3．783，P=0．000），且活動(dòng)期更為明顯（F=17．812，P=0．000）。SLE患者血清PRL水平與SLEDAI呈正相關(guān)（r=0．568，P=0．

14、000）。 2．HPRL的SLE患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀如頭痛、癲癇發(fā)作、腎損害、抗ds-DNA抗體陽(yáng)性、皮疹及口腔潰瘍的發(fā)生率顯著高于血清PRL正常者（P<0．05），而補(bǔ)體C3、C4下降、發(fā)熱、血液系統(tǒng)受累及漿膜炎等的發(fā)生率則無(wú)明顯差異。 3．①HPRL的SLE患者組PBMC分泌IL-6、總STAT5表達(dá)水平及STAT5磷酸化（p-STAT5）程度均顯著高于正常PRL的SLE患者組和正常對(duì)照組（P<0．05）。

15、②HPRL的SLE患者組PBMC加入AG490培養(yǎng)后，IL-6、總STAT5及p-STAT5的表達(dá)均較前顯著降低（P<0．05）。 ③HPRL的SLE患者組PBMC加入thPRL和AG490共同培養(yǎng)后，IL-6、總STAT5及p-STAT5的表達(dá)較前均顯著降低（P<0．05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)HPRL的SLE患者組PBMC加thPRL和AG490共同培養(yǎng)后IL-6及STAT5表達(dá)水平較單獨(dú)加用AG490時(shí)有所增加（P=0．000）。

16、 4．①PRL正常的SLE患者組PBMC經(jīng)rhPRL刺激后，IL-6、總STAT5及p-STAT5的表達(dá)水平較前顯著增加（P<0．05）。 ②與正常對(duì)照組相比，經(jīng)rhPRL刺激后，PRL正常的SLE患者IL-6、總STAT5的表達(dá)水平明顯增加（P=0．000），但p-STAT5表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P=0．135）。 ③PRL正常的SLE患者組加入thPRL和AG490前后，IL-6及總STAT5表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

17、義（P<0．05），但p-STAT5水平無(wú)明顯改變（P=0．067）。 結(jié)論: 1．SLE患者血清PRL增高與其病情活動(dòng)明顯相關(guān)，可作為判定SLE疾病活動(dòng)的指標(biāo)之一。 2．無(wú)論是外源性還是內(nèi)源性PRL均可上調(diào)SLE患者PBMC內(nèi)總STAT5、p-STAT5和IL-6的表達(dá)水平，AG490能明顯抑制這種調(diào)節(jié)作用。 3．AG490可通過(guò)下調(diào)總STAT5及p-STAT5的表達(dá)水平，而對(duì)內(nèi)源性、外源性PRL誘導(dǎo)的