EB病毒與細(xì)胞因子HGF協(xié)同影響鼻咽癌血管生成和細(xì)胞黏附的研究.pdf

1、鼻咽癌是高發(fā)于中國(guó)南方和東南亞地區(qū)的惡性腫瘤性疾病。在生物學(xué)行為方面，鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，常于發(fā)病早期即發(fā)生鄰近部位的侵襲和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，在臨床上，幾乎四分之三的鼻咽癌患者在初次就診時(shí)就已伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在組織病理學(xué)方面，于流行區(qū)高發(fā)的非角化性癌組織中常常伴有大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴細(xì)胞究竟在此過程中扮演何種角色，是否如一般所理解的淋巴細(xì)胞可以免疫性殺傷腫瘤細(xì)胞而保護(hù)機(jī)體，還是相反起著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞演化、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用?這既是鼻咽癌組織

2、形態(tài)上的特點(diǎn)，實(shí)際上也是鼻咽癌發(fā)展演進(jìn)的關(guān)鍵性問題，同時(shí)還關(guān)系到腫瘤的臨床治療和預(yù)后。 對(duì)鼻咽癌的病因?qū)W研究己明確EB病毒是導(dǎo)致鼻咽癌的一類致癌病毒。EBV又名人類皰疹病毒IV型，是一種雙鏈DNA病毒，是人皰疹病毒科γ亞科中唯一能引起人類感染的淋巴濾泡病毒。很多研究證據(jù)已經(jīng)證實(shí)，EBV是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的一種關(guān)鍵因素。EBV的基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可編碼多種蛋白，參與病毒的感染、轉(zhuǎn)化和致病。EBV編碼的潛伏膜蛋白-1是一種重要的蛋白，是

3、EBV參與鼻咽癌上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化唯一相關(guān)的癌蛋白。但是，EBV轉(zhuǎn)化鼻咽黏膜上皮細(xì)胞，導(dǎo)致鼻咽癌的發(fā)生、演進(jìn)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，目前還有很多機(jī)制不明。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成并分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，它們介導(dǎo)細(xì)胞之間的信息交換與相互調(diào)節(jié)，參與免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)過程。細(xì)胞因子的作用具有多功能性和通用性，細(xì)胞因子之間可相互協(xié)同或拮抗。近年來發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤，如鼻咽癌、Burkitt's淋巴瘤、胃癌、

4、肺癌、肝癌、乳腺癌等均有細(xì)胞因子表達(dá)水平的改變。在腫瘤發(fā)生、組織修復(fù)、細(xì)胞分化和增殖中起重要作用。鼻咽癌細(xì)胞和間質(zhì)中的淋巴細(xì)胞均可以分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子對(duì)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是否有重要作用，目前尚未明確。 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子是一種多肽生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、組織成形，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞遷移、侵襲以及誘導(dǎo)血管生成等作用。原癌基因met編碼的c-Met蛋白屬于生長(zhǎng)因子受體類，是至今唯一被認(rèn)識(shí)的HGF高親和力受體，并可在多種腫瘤細(xì)胞中

5、過表達(dá)。HGF/c-Met的過表達(dá)與腫瘤不良預(yù)后、侵襲深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為腫瘤的危險(xiǎn)因素指標(biāo)。HGF/c-Met對(duì)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是否有重要作用，正是值得注意但又尚未研究的問題。 血管生成是腫瘤細(xì)胞獲得營(yíng)養(yǎng)的前提條件，淋巴管和微血管數(shù)量增加也加大了腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)率增加。腫瘤微血管生成與多種血管生成因子的表達(dá)相關(guān)。IL-8是一類中性粒細(xì)胞趨化因子，具有多種功能：促進(jìn)血管生成，誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞

6、移動(dòng)、增殖，促使細(xì)胞表達(dá)黏附分子，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。但在鼻咽癌組織中，IL-8表達(dá)上調(diào)的機(jī)制至今尚未明了。 惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)，以及腫瘤細(xì)胞之間相互作用的結(jié)果。細(xì)胞黏附在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用。鼻咽癌早期發(fā)生組織侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)一直受到關(guān)注，但其機(jī)制至今仍不清楚。在與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的諸多因素中，上皮型鈣黏素的作用越來越顯示出重要性。在人類多種腫瘤組織中，ECD表達(dá)缺失或降低

7、都表明其與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，但其作用和調(diào)控的分子機(jī)制尚未完全明確。 盡管有線索提示EBV與HGF/c-Met系統(tǒng)在多種人類腫的發(fā)生、演進(jìn)過程中起到了協(xié)同作用，但結(jié)論尚不肯定。不同類型的腫瘤，以及腫瘤所處的不同臨床分期，都有可能影響EBV感染與HGF/c—Met系統(tǒng)的相互作用關(guān)系，從而導(dǎo)致不一致的研究結(jié)果。在鼻咽癌的發(fā)生演進(jìn)過程中，EBV和HGF/c—Met系統(tǒng)是否起到協(xié)同促進(jìn)作用，目前尚無研究，本研究的目的是通過研究這兩

8、個(gè)因素在鼻咽癌血管生成、細(xì)胞黏附性等方面的協(xié)同關(guān)系而探討其對(duì)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的影響。 材料與方法：收集2000年11月-2005年11月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷明確未經(jīng)治療的鼻咽癌病例60例，采用免疫組化染色方法檢測(cè)鼻咽癌組織中HGF、c-Met、LMP-1、IL-8、CD34、ECD的表達(dá)。將組織蠟塊制作成組織芯片，采用EBV探針原位雜交試劑盒進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，分析鼻咽癌組織中EBERs的表達(dá)情況。 培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞株CN

9、E-2、C666和EBV轉(zhuǎn)化的永生化猴淋巴細(xì)胞B95.8。分別抽提基因組DNA，采用PCR方法擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)EBV BamH Ⅰ-W片段，以確定細(xì)胞株EBV感染狀況。另外，采用不同濃度外源性細(xì)胞因子HGF體外誘導(dǎo)CNE-2、C666細(xì)胞株，用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-8的濃度，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和RT-PCR方法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)狀況；進(jìn)行細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，觀察不同濃度外源性細(xì)胞因子HGF對(duì)細(xì)胞黏附性的影響。 結(jié)果：

10、1.本研究收集的60例鼻咽癌病例標(biāo)本，男性41例(68.33％)，女性19例(31.67％)，發(fā)病年齡29～73歲，平均年齡45.3歲。其中角化性鱗狀細(xì)胞癌4例(6.67％)，分化型非角化性癌14例(23.33％)，未分化型非角化性癌42例(70.00％)。60例鼻咽癌組織中，15例(25.00％)癌細(xì)胞呈Schmincke型生長(zhǎng)方式，23例(38.33％)呈Regaud型生長(zhǎng)方式，混合型為22例(36.67％)。 2.EBER

11、s表達(dá)陽(yáng)性率為93.34％(56/60)。絕大多數(shù)癌細(xì)胞胞核均可見EBERs陽(yáng)性信號(hào)，浸潤(rùn)前期病變(包括鼻咽被覆上皮或隱窩上皮不同程度不典型增生和原位癌)亦可見到數(shù)量不等的異型細(xì)胞呈EBERs陽(yáng)性表達(dá)。 3.鼻咽癌組織中細(xì)胞因子HGF主要在癌巢周圍間質(zhì)淋巴細(xì)胞中表達(dá)，陽(yáng)性率為75.00％(45/60)，28.33％(17/60)的病例癌細(xì)胞亦呈HGF陽(yáng)性，遠(yuǎn)低于HGF在間質(zhì)淋巴細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.01)。鼻咽癌組織中c-Met

12、表達(dá)陽(yáng)性率為85.00％(51/60)。LMP-1表達(dá)陽(yáng)性率為36.67％(22/60)。IL-8表達(dá)陽(yáng)性率為45.00％(27/60)。ECD表達(dá)陽(yáng)性率為71.67％(43/60)。 4.細(xì)胞因子HGF在以Schmincke型生長(zhǎng)方式的癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于以Regaud型生長(zhǎng)方式的癌細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，但與其它臨床病理指標(biāo)則均無明顯聯(lián)系。 5.癌巢周圍間質(zhì)淋巴細(xì)胞表達(dá)的HGF與癌細(xì)胞表達(dá)的H

13、GF呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.292，P=0.023)；淋巴細(xì)胞表達(dá)的HGF與癌細(xì)胞表達(dá)的c-Met呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.469，P=0.000)；癌細(xì)胞表達(dá)的HGF與c-Met呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.893，P=0.000)；癌細(xì)胞表達(dá)的LMP-1與IL-8呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.509，P=0.000)，癌細(xì)胞表達(dá)的c-Met和癌組織微血管密度呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.276，P=0.033)。另外，癌細(xì)胞LMP-1和淋巴細(xì)胞HGF同

14、時(shí)表達(dá)病例的癌細(xì)胞IL-8表達(dá)明顯增高(P<0.01)。 6.鼻咽癌組織的平均微血管密度為14.88±6.15/高倍視野。癌巢周圍間質(zhì)淋巴細(xì)胞HGF表達(dá)陽(yáng)性組的微血管密度(16.06±6.12/高倍視野)高于HGF表達(dá)陰性組(11.35±5.13/高倍視野)，P=0.010；癌細(xì)胞IL-8表達(dá)陽(yáng)性組微血管密度(16.40±4.25/高倍視野)高于IL-8表達(dá)陰性組(13.37±5.91/高倍視野)，P=0.046。 7.

15、EBV BamH I-W片斷PCR結(jié)果證實(shí)：CNE-2為EBV感染陰性株、C666為EBV感染陽(yáng)性株。 8.CNE-2、C666細(xì)胞株在不同濃度外源性細(xì)胞因子HGF處理后24小時(shí)后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示ECD表達(dá)未出現(xiàn)差異性改變。 9.CNE-2細(xì)胞株在不同濃度的外源性細(xì)胞因子HGF處理24小時(shí)后，上清液中IL-8濃度明顯上升；但C666細(xì)胞株在HGF處理后，培養(yǎng)上清IL-8濃度未出現(xiàn)差異性改變。 10.RT-P

16、CR結(jié)果顯示，CNE-2和C666細(xì)胞株在外源性細(xì)胞因子HGF刺激后c-Met表達(dá)水平均增加。但無論細(xì)胞因子HGF刺激與否，CNE-2和C666細(xì)胞株均不表達(dá)內(nèi)源性HGF。C666細(xì)胞株表達(dá)LMP-1，但其表達(dá)水平在細(xì)胞因子HGF刺激前后無顯著性差異。 11.外源性細(xì)胞因子HGF刺激能增加CNE-2細(xì)胞株的細(xì)胞．基質(zhì)黏附性，但對(duì)C666細(xì)胞株的細(xì)胞．基質(zhì)黏附性影響卻不明顯。 結(jié)論： 1.EBV在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中起

17、重要作用，鼻咽癌前驅(qū)病變已經(jīng)有EBV感染。 2.EBV編碼的LMP-1蛋白可能通過上調(diào)鼻咽癌組織中細(xì)胞因子IL-8的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤內(nèi)微血管生成，在癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中起作用。 3.鼻咽癌間質(zhì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的外源性細(xì)胞因子HGF可能通過旁分泌途徑激活鼻咽癌細(xì)胞受體c-Met，上調(diào)鼻咽癌組織中IL-8表達(dá)，促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生微血管形成；并可能通過非ECD途徑改變癌細(xì)胞的黏附性，從而在癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。 4.鼻咽