阿爾茨海默病中microRNA29c對(duì)APP、BACE1蛋白的負(fù)性表達(dá)調(diào)控.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是老年人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。1907年由德國(guó)精神科醫(yī)生Alois Alzheimer首先提出并以他的名字命名。臨床表現(xiàn)為隱襲起病,逐漸出現(xiàn)記憶力減退、認(rèn)知功能障礙、行為異常和社交障礙。病情呈進(jìn)行性加重,逐漸喪失獨(dú)立生活能力,發(fā)病后10～20年因并發(fā)癥而死亡。AD可分為家族性(FAD)和散發(fā)性或遲發(fā)性(SAD/LOAD)。主要三大病理變化是神經(jīng)細(xì)胞外老年斑沉積、神經(jīng)元內(nèi)神

2、經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元缺失等。阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。四個(gè)突變基因在AD中起重要作用,APP、PS1、PS2家族性AD中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)基因,及一個(gè)在散發(fā)性AD中的危險(xiǎn)因素基因ApoE。目前,雖然在基因水平對(duì)家族性阿爾茨海默病已經(jīng)有了深入地了解。但是,我們對(duì)AD從基因突變到Aβ沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失、神經(jīng)突觸可塑性改變、記憶學(xué)習(xí)能力缺失等病理發(fā)生機(jī)制并不了解。Aβ、Tau、PS和ApoE等均在AD的發(fā)病過程中起到重要作用,但

3、以上述幾個(gè)方面做為靶點(diǎn)的治療未能取得令人滿意的效果。因此,從新的角度來研究AD的發(fā)病機(jī)制,從而為其治療提供新的思路是十分必要的。
　　 microRNA的出現(xiàn)為AD的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的思路。microRNA(微小RNA,簡(jiǎn)稱miRNA)是生物體內(nèi)源長(zhǎng)度約為20—23個(gè)核苷酸的非編碼小RNA,通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控,導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。由于miRNAs在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守,在

4、植物、動(dòng)物和真菌中發(fā)現(xiàn)的miRNAs只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá),而且這種特異性和時(shí)序性,決定了組織和細(xì)胞的功能特異性,表明miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。在哺乳動(dòng)物體內(nèi),miRNA通過與mRNA的3’UTR部分互補(bǔ),進(jìn)而阻止其翻譯、脫甲基化帽子或脫腺苷化。從而抑制某靶基因蛋白的表達(dá)。許多的miRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達(dá)或大量表達(dá),其參與了神經(jīng)分化,突觸可塑性及記憶形成。通過預(yù)測(cè)認(rèn)為microRNA與人類神經(jīng)系統(tǒng)

5、疾病密切相關(guān)。但有關(guān)microRNA對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的研究仍然處于起步階段。本課題為了探討microRNA在阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展過程中的作用,我們采用了microRNA芯片檢測(cè)3月齡、6月齡APP/PS雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型大腦中microRNA達(dá)情況,并通過實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)microRNA29c在3月、6月、9月齡小鼠中表達(dá)明顯升高。通過microRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase、miRanda、PicTar和Targ

6、etScan四種數(shù)據(jù)庫(kù)綜合篩選出5種與阿爾茨海默病相關(guān)的靶基因,在穩(wěn)定高表達(dá)microRNA29c的SH-SY5Y細(xì)胞系中通過western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)APP、BACE1、NAV3、PI15蛋白的表達(dá)減少。共轉(zhuǎn)染microRNA29c表達(dá)載體及APP、BACE1、PI15表達(dá)載體到HEK-293T細(xì)胞,western blot檢測(cè)APP、BACE1蛋白明顯減少,而PI15蛋白表達(dá)水平?jīng)]有減少。說明microRNA29c能夠直接抑制

7、APP、BACE1蛋白的表達(dá)。通過將靶基因APP與NAV3信使RNA的3’UTR序列克隆到雙熒光素酶報(bào)告基因載體,在HEK-293T細(xì)胞中通過雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染microRNA29c細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)明顯減少,較對(duì)照分別減少30％、74％,證明了microRNA29c對(duì)APP與NAV3基因的負(fù)向調(diào)控作用靶點(diǎn)均位于mRNA的3’UTR。通過點(diǎn)突變方法構(gòu)建了帶有突變結(jié)合靶點(diǎn)的APP3’UTR熒光素酶報(bào)告基因載體,在293T細(xì)胞

8、中確定了microRNA29c在APPmRNA的3’UTR至少有兩個(gè)結(jié)合靶點(diǎn)。成功構(gòu)建了microRNA29c轉(zhuǎn)基因小鼠,microRNA29c轉(zhuǎn)基因小鼠高表達(dá)miR-29c,并在小鼠體內(nèi)進(jìn)一步證實(shí)了microRNA29c抑制靶基因APP及BACE1表達(dá)。microRNA29c轉(zhuǎn)基因小鼠為進(jìn)一步研究microRNA29c在體內(nèi)的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 本課題通過在體外細(xì)胞水平及模型小鼠體內(nèi)證實(shí)了microRNA29c對(duì)靶基因