硫化氫調(diào)節(jié)大鼠不同腦區(qū)神經(jīng)元興奮性及其在癲癇發(fā)作和攝食調(diào)控中的作用.pdf

1、第一部分硫化氫對(duì)大鼠海馬CA1腦區(qū)AMPA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的作用及機(jī)制
　　目的：硫化氫是一種氣體信號(hào)分子，參與對(duì)神經(jīng)突觸可塑性傳遞和學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)。但是關(guān)于硫化氫調(diào)節(jié)突觸可塑性的分子機(jī)制，目前尚未研究清楚。本課題即從硫化氫對(duì)海馬腦區(qū) AMPA受體（α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acidreceptor，AMPAR）上膜的調(diào)控方面，初步探討硫化氫對(duì)海馬腦區(qū)神經(jīng)元興奮性的調(diào)

2、節(jié)作用及其分子機(jī)制。
　　方法：通過(guò)基于生物素交聯(lián)的硫巰基化檢測(cè)方法，研究硫化氫對(duì)大鼠海馬 CA1腦區(qū)總蛋白、AMPAR和蛋白磷酸酯酶的硫巰基化作用。腦片膜片鉗記錄硫化氫對(duì)海馬CA1腦區(qū)神經(jīng)元AMPAR電流的作用。BS3交聯(lián)和蛋白質(zhì)免疫印跡方法，研究硫化氫對(duì)CA1腦區(qū)AMPAR亞基的磷酸化上膜和蛋白激酶磷酸化的作用。
　　結(jié)果：硫化氫供體硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS，100μM）不影響大鼠海馬C

3、A1區(qū)AMPAR亞基GluA1和GluA2的總蛋白表達(dá)，也不改變GluA2的膜表達(dá)，但能顯著增加 GluA1膜表達(dá)和AMPAR介導(dǎo)的電流強(qiáng)度。硫巰基化阻斷劑DTT（二硫蘇糖醇，dithiothreitol，100μM）抑制NaHS引起的大鼠海馬CA1腦區(qū)AMPAR膜表達(dá)及其介導(dǎo)的電流強(qiáng)度。NaHS增加大鼠CA1腦區(qū)總蛋白硫巰基化水平，而對(duì)GluA1、GluA2的硫巰基化水平無(wú)顯著影響。同時(shí)，NaHS增加GluA1亞基Ser845位點(diǎn)和S

4、er831位點(diǎn)磷酸化水平。另外，DTT能取消NaHS對(duì)海馬CA1腦區(qū)蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、鈣離子和鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶II（Ca2+/calmodulindependent protein kinase II，CaMKII）的激活作用。NaHS選擇性地上調(diào)蛋白磷酯酶2A（protein phosphatase2A，PP2A）的硫巰基化水平，因此可能

5、通過(guò)抑制PP2A活性而上調(diào)突觸后蛋白激酶信號(hào)以及GluA1的磷酸化和功能。
　　結(jié)論：硫化氫通過(guò)硫巰基化作用途徑促進(jìn)大鼠海馬 CA1腦區(qū) AMPAR亞基GluA1-Ser845和Ser831位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)而上調(diào)AMPAR的膜表達(dá)和突觸后信號(hào)傳遞功能。
　　第二部分硫化氫對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元興奮性及癲癇樣行為的作用及機(jī)制
　　目的：癲癇是伴隨腦卒中的一種常見(jiàn)并發(fā)癥，約占腦卒中患者總數(shù)的3％。然而，癲癇與腦卒中兩者之間的內(nèi)在

6、機(jī)制聯(lián)系，仍然不甚明了。硫化氫作為一種氣體信號(hào)分子，在缺血性大腦損傷過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。但是關(guān)于硫化氫在癲癇發(fā)作中的作用，目前還沒(méi)有相應(yīng)的研究報(bào)道。在本部分研究?jī)?nèi)容中，我們初步探討了硫化氫對(duì)癲癇樣事件的影響及其機(jī)制。
　　方法：在戊四氮唑（pentylenetetrazole，PTZ）和毛果蕓香堿（pilocarpine）誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型上，檢測(cè)硫化氫對(duì)模型癲癇發(fā)作的影響。在低鎂高鉀癲癇模型和4-氨基吡啶（4-amino-pyr

7、idine，4-AP）誘導(dǎo)的腦片癲癇模型上，通過(guò)膜片鉗記錄的方法，研究硫化氫對(duì)癲癇樣動(dòng)作電位發(fā)放、興奮性突觸后電流（excitatory postsynaptic currents，EPSCs）、電壓門控型鈉離子通道（voltage-gated sodium channels，VGSCs）電流、興奮性谷氨酸受體離子通道（AMPAR和NMDAR）電流的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：腹腔注射NaHS（11.2 mg/kg）增強(qiáng)戊四氮唑以及毛果

8、蕓香堿誘發(fā)的癲癇模型發(fā)作。NaHS在腦片水平上延長(zhǎng)低鎂高鉀誘導(dǎo)的癲癇樣動(dòng)作電位的持續(xù)發(fā)放時(shí)程。在不同的鉗制電流下（110-200 pA）單獨(dú)使用NaHS，能夠增加大鼠腦片上動(dòng)作電位的發(fā)放頻率。NaHS上調(diào)大鼠皮層神經(jīng)元自發(fā)型興奮性突觸后電流（spontaneousexcitatory postsynaptic currents，sEPSC）的幅度和微小型興奮性突觸后電流（miniatureexcitatory postsynaptic

9、currents，mEPSC）的幅度。在不影響VGSCs的激活、失活和復(fù)活特性的情況下，NaHS能增大VGSCs的電流幅度。另外，NaHS能夠增加皮層神經(jīng)元總的誘發(fā)型興奮性突觸后電流（evoked excitatory postsynaptic currents，e-EPSC）幅度至對(duì)照組的146.4±10.9%、AMPAR介導(dǎo)的e-EPSC幅度至對(duì)照組的143.5±6.6%，以及NMDAR介導(dǎo)的e-EPSC幅度至對(duì)照組的128.1±3

10、.1%。使用電壓門控型鈉通道阻滯劑TTX（1 nmol）、NMDAR阻滯劑AP-5（100 nmol）和AMPAR阻滯劑CNQX（20 nmol）均能取消 NaHS對(duì)低鎂高鉀誘導(dǎo)的癲癇樣發(fā)放以及戊四氮誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型發(fā)作的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：硫化氫通過(guò)上調(diào)電壓門控型鈉通道和谷氨酸受體通道活性，增強(qiáng)大腦皮層神經(jīng)元的興奮性，易化大鼠癲癇樣事件的發(fā)生。
　　第三部分硫化氫對(duì)大鼠ARC腦區(qū)神經(jīng)元活性及攝食行為的作用及機(jī)制

11、　　目的：硫化氫在機(jī)體的許多器官和組織中起到重要的生理或病理作用。已有研究報(bào)道提示，內(nèi)源性硫化氫可能對(duì)能量代謝和攝食具有調(diào)控作用。下丘腦弓狀核（arcuate nucleus，ARC）是控制機(jī)體能量代謝與攝食行為的關(guān)鍵調(diào)節(jié)中樞。饑餓狀態(tài)下ARC腦區(qū)neuropeptide Y（NPY）神經(jīng)元興奮，能量平衡因子AMP-activated protein kinase（AMPK）活性升高，介導(dǎo)攝食行為。本部分課題研究硫化氫對(duì)ARC神經(jīng)元AM

12、PK活性和攝食的調(diào)控作用。
　　方法：采用大鼠腦室置管給藥、攝食行為測(cè)試、原代神經(jīng)元培養(yǎng)、western blotting免疫印跡、生物素交聯(lián)法和蛋白質(zhì)硫巰基水平檢測(cè)、鈣離子影像、氣體吸入給藥、細(xì)胞免疫熒光與親和素免疫組織化學(xué)（親和素-生物素-過(guò)氧化物酶法）的方法，研究硫化氫對(duì)大鼠攝食行為的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制。
　　結(jié)果：腹腔注射NaHS（8.4 mg/kg）可顯著短暫（1 h）增加大鼠攝食行為。NaHS上調(diào)ARC神經(jīng)元c-

13、Fos的核表達(dá)。在整體動(dòng)物和離體腦片水平，NaHS濃度依賴性地增加下丘腦弓狀核AMPK和CaMKII活性。此外，100μMNaHS促進(jìn)原代培養(yǎng)ARC神經(jīng)元AMPK和CaMKII的激活。同時(shí)，NaHS促進(jìn)ARC神經(jīng)元胞漿游離鈣離子水平[Ca2+]i的升高，而胞漿游離鈣離子螯合劑BAPTA-AM（10μM）能阻斷硫化氫對(duì)AMPK的激活作用。NaHS不改變ARC總蛋白巰基水平而上調(diào)蛋白硫巰基化水平，該作用能被硫巰基化修飾阻斷劑DTT（100μ

14、M）所阻斷。DTT能取消硫化氫對(duì)胞漿鈣離子水平、AMPK激活和大鼠攝食的上調(diào)作用。氣體吸入硫化氫（20 ppm）顯著增加ARC蛋白硫巰基化、AMPK激活以及大鼠攝食。禁食24 h不改變下丘腦內(nèi)的硫化氫合酶——胱硫醚β合酶（cystathionineβ-synthase，CBS）的表達(dá)，但增加蛋白硫巰基化和AMPK激活水平。DTT可阻斷禁食引起的蛋白硫巰基化、AMPK激活和再攝食的增加。
　　結(jié)論：硫化氫通過(guò)硫巰基化作用，增強(qiáng)ARC