白頭翁湯及其主要成分抗大腸桿菌內(nèi)毒素的作用機(jī)理研究.pdf

1、大腸桿菌病是一種急性傳染病，該病傳播迅速，病死率高，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約著畜牧產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。當(dāng)前臨床治療手段多采用抗菌藥物或高免血清，但長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素容易產(chǎn)生耐藥性和獸藥殘留，對(duì)動(dòng)物和人類的健康均會(huì)造成嚴(yán)重的危害；高免血清因?yàn)槌杀据^高、產(chǎn)量較低，從而限制了其的廣泛應(yīng)用。中藥白頭翁湯用于防治感染性疾病在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床都有廣泛實(shí)踐，并以確切的療效和較低的毒副殘留及抗藥性而廣受歡迎。本研究測(cè)定了白頭翁湯抗大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS)的作用和

2、對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MVEC)基因表達(dá)譜的影響，以及白頭翁湯及其主要成分對(duì)LPS誘導(dǎo)MVEC分泌NO、ET-1、 IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α、E-selectin、TXB2和6-keto-PGF1α的影響，旨在探討白頭翁湯的抗內(nèi)毒素作用和抗炎機(jī)制，為臨床應(yīng)用白頭翁湯防治細(xì)菌內(nèi)毒素性疾病提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容分為以下八部分：
　　 實(shí)驗(yàn)Ⅰ白頭翁湯抗大腸桿菌內(nèi)毒素的作用觀察取中藥飲片按常規(guī)方法煎

3、制成生藥濃度為1g/mL的白頭翁湯藥液，分高、中、低三個(gè)劑量給小鼠灌胃，每天1次，連續(xù)5天。第一次給藥前3h和最后一次給藥后3h分別腹腔注射LPS。記錄LPS攻毒后48h內(nèi)小鼠的死亡率，同時(shí)測(cè)定各組小鼠的體溫、體重、血像及器官指數(shù)。結(jié)果，治療高劑量組、預(yù)防高劑量和中劑量組的小鼠死亡率顯著低于LPS對(duì)照組。治療各劑量組和預(yù)防各劑量組的小鼠體溫在6h和12h時(shí)均顯著或極顯著高于LPS對(duì)照組.治療高劑量組和預(yù)防高劑量組的小鼠體重在24h時(shí)顯著

4、高于LPS對(duì)照組。治療高劑量組的小鼠白細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白濃度、平均血紅蛋白量和血小板數(shù)量較LPS對(duì)照組均顯著升高。治療高劑量組小鼠的肝臟、脾臟和腸管指數(shù)顯著低于LPS對(duì)照組。表明白頭翁湯具有明顯的抗大腸桿菌內(nèi)毒素作用.
　　 實(shí)驗(yàn)Ⅱ大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定從1日齡SD大鼠的空腸段分離腸黏膜，用胰蛋白酶消化法分離微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cell,MVEC)，培養(yǎng)，用差速消化法

5、和差速貼壁法，進(jìn)一步純化、傳代。用形態(tài)學(xué)觀察法、第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光法和硝酸銀染色法進(jìn)行綜合鑒定。結(jié)果證實(shí)，大鼠腸黏膜MVEC培養(yǎng)成功，操作方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞純度理想、性質(zhì)穩(wěn)定。為下一步研究LPS和PD對(duì)MVEC分泌功能的影響提供了實(shí)驗(yàn)材料。
　　 實(shí)驗(yàn)Ⅲ白頭翁湯對(duì)LPS誘導(dǎo)MVEC基因表達(dá)譜的影響將MVEC培養(yǎng)至單層融合狀態(tài)，先后加入LPS和白頭翁湯作用12h后，提取三個(gè)處理組的總RNA。采用基因芯片檢測(cè)，讀取

6、各組基因表達(dá)的變化情況并進(jìn)行生物學(xué)分析。結(jié)果，LPS組比空白組產(chǎn)生69個(gè)差異表達(dá)基因，LPS-PD組比LPS組產(chǎn)生578個(gè)差異表達(dá)基因，LPS-PD組比空白組產(chǎn)生122個(gè)差異表達(dá)基因。分析各組差異基因發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯通過減少炎癥因子的翻譯，抑制凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，加速機(jī)體蛋白的合成，增強(qiáng)細(xì)胞能量的代謝等方面來(lái)對(duì)抗LPS所產(chǎn)生的各項(xiàng)毒理效應(yīng)。
　　 實(shí)驗(yàn)Ⅳ LPS誘導(dǎo)的MVEC差異表達(dá)基因的Real-time RT-PCR分析在基因芯片

7、實(shí)驗(yàn)樣品中選取5個(gè)與炎癥反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)基因，采用Primer5.0軟件在所選基因的上下游各設(shè)計(jì)一條引物，用嵌合熒光法進(jìn)行Real-time RT-PCR反應(yīng)。5個(gè)目標(biāo)基因Il1a、I16、Edn1、Tnfsfl1和Ptges的Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果依次為9.78、1.76、1.43,2.98和2.12，對(duì)應(yīng)的基因芯片檢測(cè)結(jié)果分別是10.57、1.53、1.59、3.16和1.71，兩者的變化趨勢(shì)高度一致.表明，基因

8、芯片的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，進(jìn)一步證實(shí)了白頭翁湯抗LPS的藥理作用。
　　 實(shí)驗(yàn)V白頭翁湯及其主要成分對(duì)LPS誘導(dǎo)MVEC分泌NO和ET-1的影響培養(yǎng)MVEC至單層融合狀態(tài)，加入LPS刺激，3h后加入高、中、低3種濃度的白頭翁湯及其主要成分，繼續(xù)培養(yǎng)21h后收集細(xì)胞上清液，測(cè)定NO和ET-1的含量。結(jié)果，白頭翁湯高劑量組和中劑量組、白頭翁素高劑量組和中劑量組、小檗堿高劑量組和中劑量組、秦皮乙素高劑量組的NO含量顯著低于LPS對(duì)照組；白頭

9、翁湯中劑量組、白頭翁素高劑量組和中劑量組、秦皮乙素高劑量組和中劑量組的ET-1含量顯著低于LPS對(duì)照組。表明，白頭翁湯可在由NO和ET-1介導(dǎo)的機(jī)體腹瀉、水腫等血管性疾病中發(fā)揮治療作用。
　　 實(shí)驗(yàn)Ⅵ白頭翁湯及其主要成分對(duì)LPS誘導(dǎo)MVEC分泌IL-1α,IL-6和IL-8的影響培養(yǎng)MVEC至單層融合狀態(tài)，加入LPS刺激，3h后加入高、中、低3種濃度的白頭翁湯及其主要成分，繼續(xù)培養(yǎng)21h后收集細(xì)胞上清液，測(cè)定IL-1α，IL-6

10、和IL-8的含量。結(jié)果，白頭翁湯高劑量組、白頭翁皂苷B4高劑量組和中劑量組、小檗堿高劑量組和中劑量組、巴馬汀高劑量組的IL-1α含量顯著低于LPS對(duì)照組；白頭翁湯高劑量組和中劑量組、白頭翁素高劑量組、秦皮甲素高劑量組和中劑量組、秦皮乙素高劑量組的IL-6含量顯著低于LPS對(duì)照組；白頭翁湯高劑量組、秦皮甲素高劑量組和中劑量組、秦皮乙素高劑量組和中劑量組的IL-8含量顯著低于LPS對(duì)照組。表明，白頭翁湯可在由IL-1α，IL-6和IL-8介

11、導(dǎo)的機(jī)體全身炎癥反應(yīng)綜合癥、多器官功能障礙綜合征等免疫性疾病中發(fā)揮治療作用。
　　 實(shí)驗(yàn)Ⅶ白頭翁湯及其主要成分對(duì)LPS誘導(dǎo)MVEC分泌TNF-α和E-selectin的影響培養(yǎng)MVEC至單層融合狀態(tài)，加入LPS刺激，3h后加入高、中、低3種濃度的白頭翁湯及其主要成分，繼續(xù)培養(yǎng)21h后收集細(xì)胞上清液，測(cè)定TNF-α和E-selectin的含量。結(jié)果，白頭翁湯高劑量組和中劑量組、白頭翁皂苷B4高劑量組和中劑量組、小檗堿高劑量組和中劑

12、量組、藥根堿中劑量組、秦皮甲素高劑量組的TNF-α含量顯著低于LPS對(duì)照組；白頭翁湯高劑量組、白頭翁皂苷B4高劑量組、小檗堿高劑量組、藥根堿高劑量組和中劑量組的E-selectin含量顯著低于LPS對(duì)照組。表明，白頭翁湯可在由TNF-α和E-selectin介導(dǎo)的機(jī)體發(fā)熱、炎癥等感染性疾病中發(fā)揮治療作用。
　　 實(shí)驗(yàn)Ⅷ白頭翁湯及其主要成分對(duì)LPS誘導(dǎo)MVEC分泌TXB2和6-keto-PGF1α的影響培養(yǎng)MVEC至單層融合狀態(tài)，

13、加入LPS刺激，3h后加入高、中、低3種濃度的白頭翁湯及其主要成分，繼續(xù)培養(yǎng)21h后收集細(xì)胞上清液，測(cè)定TXB2和6-keto-PGFiα的含量。結(jié)果，白頭翁湯高劑量組和中劑量組、白頭翁素高劑量組、小檗堿中劑量組、藥根堿高劑量組和中劑量組、巴馬汀高劑量組和中劑量組的TXB2含量顯著低于LPS對(duì)照組；秦皮乙素高劑量組的6-keto-PGF1α含量顯著低于LPS對(duì)照組。表明，白頭翁湯可在由TXB2和6-keto-PGF1α介導(dǎo)的機(jī)體彌散性血