納米氧化物介導(dǎo)腫瘤綜合治療的實驗研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類健康。手術(shù)、化療、放療、生物治療、光動力學(xué)療法、中醫(yī)中藥等是目前常用的治療方法,然而單純依靠某一種治療方法很難取得理想的效果,利用多學(xué)科的優(yōu)勢資源,將多種治療手段有機(jī)地結(jié)合起來,以達(dá)到更佳治療效果的腫瘤綜合治療(synthetic therapy)是腫瘤治療當(dāng)前熱點,已成為腫瘤治療的基本原則?；熑允瞧駷橹怪饕哪[瘤治療手段,臨床化療失敗的一個重要原因是腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MD

2、R),對其有效逆轉(zhuǎn)和診斷尤為迫切。隨著納米科技的迅猛發(fā)展,納米材料在腫瘤診斷和治療中顯示出了極大的優(yōu)勢和巨大的應(yīng)用潛力。本論文將納米氧化鋅(ZnO nanorods)、納米二氧化鈦(TiO2 nanoparticles)的研究應(yīng)用擴(kuò)展至腫瘤綜合治療方向,主要研究內(nèi)容如下:
　　 第一部分:氧化鋅納米棒介導(dǎo)腫瘤綜合治療及其分子機(jī)理的實驗研究
　　 目的:
　　 本部分旨在探討基于納米氧化鋅介導(dǎo)腫瘤綜合治療及其分子機(jī)

3、理,為臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 采用簡便室溫固相的方法合成氧化鋅納米棒,透射電鏡(Transmissionelectron microscope,TEM)、X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)對其進(jìn)行表征；通過物理吸附、化學(xué)鍵合(螯合反應(yīng))的方法將柔紅霉素(daunorubicin,DNR)包封于納米氧化鋅上,制備柔紅霉素-氧化鋅納米復(fù)合物(DNR-ZnOnanocomposi

4、tes,DNR-ZnO),用作藥物傳輸系統(tǒng)(drug delivery system,DDS):流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡檢測納米氧化鋅作為藥物載體促進(jìn)肝癌SMMC-7721細(xì)胞對柔紅霉素的吸收；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法評價納米氧化鋅對SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞毒性及光動力學(xué)

5、治療(photodynamic therapy,PDT)作用；MTT法、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)熒光染色研究柔紅霉素-氧化鋅納米復(fù)合物聯(lián)合紫外光照(ultravioletirradiation)發(fā)揮藥物載體和光敏劑雙重角色,即聯(lián)合化療、光療多手段對SMMC-7721細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)。進(jìn)一步用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription

6、 polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western Blot檢測Bax、Bcl-2、Caspase9、Caspase3的基因和蛋白表達(dá)水平,闡明其抗腫瘤分子機(jī)理。
　　 結(jié)果:
　　 制得的ZnO形貌為納米棒,棒的平均寬度為20 nm、平均長度為50nm;納米氧化鋅可作為藥物載體,形成柔紅霉素-氧化鋅納米復(fù)合物,包封率和載藥量分別為75.28±6.43％和20.08±2.36％,該復(fù)合物

7、作為藥物傳輸系統(tǒng)具有pH敏感性智能控釋的特性,可增強(qiáng)柔紅霉素在肝癌SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)蓄積,提高化療效果；氧化鋅納米棒細(xì)胞毒性小,紫外光激發(fā)下可產(chǎn)生活性氧(reactive oxygenspecies,ROS),抑制腫瘤細(xì)胞增殖,可用于腫瘤光動力學(xué)治療；而且,柔紅霉素-氧化鋅納米復(fù)合物聯(lián)合紫外光照,待藥物柔紅霉素在肝癌SMMC-7721細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)釋放后,載體氧化鋅納米棒二次發(fā)揮功能,即作為光敏劑予紫外光激發(fā)下,光動力學(xué)治療腫瘤,再次

8、打擊腫瘤細(xì)胞,化療、光療協(xié)同,進(jìn)一步提高抗腫瘤效應(yīng)；通過上調(diào)Bax、Caspase9、Caspase3的基因和蛋白表達(dá),下調(diào)Bcl-2的基因和蛋白表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,是納米氧化鋅介導(dǎo)腫瘤綜合治療的主要分子機(jī)理。
　　 結(jié)論:
　　 柔紅霉素-氧化鋅納米復(fù)合物聯(lián)合紫外光照,集光療、化療、靶向、緩控釋四特性于一體,多途徑高效抑制腫瘤,納米氧化鋅可介導(dǎo)腫瘤綜合治療。因此,本實驗為腫瘤綜合治療提供了一種新思路、新方法。

9、>　　 第二部分:納米生物技術(shù)逆轉(zhuǎn)和診斷腫瘤多藥耐藥的實驗研究
　　 目的:
　　 本部分探討超聲介導(dǎo)二氧化鈦納米顆粒(TiO2 nanoparticles)攜載柔紅霉素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的新方法對白血病多藥耐藥細(xì)胞K562／A02的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制;還探討基于柔紅霉素-碳納米管超分子識別,高靈敏、強(qiáng)特異的新型生物傳感法快速、早期診斷白血病多藥耐藥。
　　 方法:
　　 物理吸附、化學(xué)鍵合(螯合反應(yīng))的方法制備納

10、米TiO2顆粒攜載柔紅霉素的納米載藥體系:柔紅霉素-二氧化鈦復(fù)合物(DNR-TiO2 complexes,DNR-TiO2)；低頻低能的溫和超聲介導(dǎo)納米藥物載體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；電化學(xué)方法測定白血病多藥耐藥細(xì)胞K562／A02對藥物柔紅霉素的吸收；MTT法檢測對細(xì)胞增殖的抑制作用；免疫組化法檢測Caspase3的表達(dá)。
　　 構(gòu)建多壁碳納米管(carbon nanotubes,CNTs)修飾的玻碳電極,電化學(xué)循環(huán)伏安法、接觸角進(jìn)行表征；

11、以藥物柔紅霉素為分子探針,直接將修飾電極置于腫瘤細(xì)胞懸液中,均相、游離、無需標(biāo),基于碳納米管-柔紅霉素超分子識別作用,考察納米界面上探針分子與白血病敏感細(xì)胞K562、多藥耐藥細(xì)胞K562／A02作用后的電化學(xué)信號,選擇性地檢測由K562／A02的“藥泵”作用排至胞外的柔紅霉素分子,以此定性地鑒別和檢出腫瘤多藥耐藥細(xì)胞；不同比例地混合K562和K562／A02白血病細(xì)胞,模擬腫瘤細(xì)胞中發(fā)生多藥耐藥的程度,根據(jù)它們的電化學(xué)信號強(qiáng)度定量地評估

12、腫瘤細(xì)胞中多藥耐藥細(xì)胞出現(xiàn)的比例。
　　 結(jié)果:
　　 納米TiO2顆粒無明顯細(xì)胞毒作用,可用作攜載柔紅霉素,柔紅霉素-二氧化鈦納米載藥體系的包封率和載藥量分別為65.46±6.82％和20.63±3.55％；電化學(xué)結(jié)果顯示:柔紅霉素-二氧化鈦納米載藥體系(TiO2:10μg／mL；DNR:10μg／mL)聯(lián)合超聲,相比單獨使用柔紅霉素、柔紅霉素聯(lián)合超聲、柔紅霉素-二氧化鈦納米載藥體系,明顯增加K562／A02細(xì)胞對柔紅

13、霉素的吸收；MTT結(jié)果表明:柔紅霉素-二氧化鈦納米載藥體系聯(lián)合超聲明顯增強(qiáng)K562／A02對柔紅霉素的敏感性,抑制率為53％,顯著高于單獨使用柔紅霉素的26％、柔紅霉素聯(lián)合超聲的34％、柔紅霉素-二氧化鈦納米載藥體系的38％,白血病多藥耐藥細(xì)胞K562／A02耐藥倍數(shù)由58.71降至16.68；同時,免疫組化顯示柔紅霉素-二氧化鈦納米載藥體系聯(lián)合超聲明顯增加K562／A02細(xì)胞caspase3的表達(dá),誘導(dǎo)其凋亡,逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥。

14、r>　　 碳納米管修飾電極顯著提高電轉(zhuǎn)導(dǎo)性能,峰電流值比裸電極約提高5倍,而且碳納米管-柔紅霉素之間能形成π鍵使得可在其它共組分中選擇性地檢測柔紅霉素探針分子；電化學(xué)探針柔紅霉素與不同表型相同濃度的白血病細(xì)胞懸液作用1h達(dá)細(xì)胞吸收藥物穩(wěn)態(tài)后,直接檢測細(xì)胞懸液的電化學(xué)信號顯示100％為敏感白血病細(xì)胞K562時陰極峰電流與相同濃度柔紅霉素對照相比,相對比例為15％,而100％為多藥耐藥細(xì)胞K562／A02時,相對比例為86％,差異明顯,可

15、定性地鑒別和檢出白血病多藥耐藥細(xì)胞；不同比例敏感和多藥耐藥腫瘤細(xì)胞組成的細(xì)胞模型中,隨著多藥耐藥腫瘤細(xì)胞K562／A02比例的增加,峰電流信號值明顯提高,相關(guān)系數(shù)R2為0.995,兩者的線性回歸方程為:(Y)=0.028X+0.42,因而,可根據(jù)峰電流信號值,依方程式逆推,可定量地得到細(xì)胞懸液中多藥耐藥白血病腫瘤細(xì)胞比例,快速、早期診斷白血病多藥耐藥。
　　 結(jié)論:
　　 超聲介導(dǎo)納米載藥體系跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),明顯增加多藥耐藥腫