生物制品質(zhì)量控制中殘留蛋白檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、傳統(tǒng)的生物制品包括疫苗、抗血清、免疫應(yīng)答產(chǎn)物、血液、血液制品及血液制品衍生物。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，生物制品所包含的范圍較傳統(tǒng)定義有了很大程度的擴(kuò)展，最主要的體現(xiàn)在現(xiàn)代生物制品的內(nèi)容包括了診斷和治療用的細(xì)胞因子和抗體、體細(xì)胞和基因以及人源和異源組織。由于生物制品大多數(shù)來(lái)源于活供體產(chǎn)生的有生物活性的合成物質(zhì)，而這類物質(zhì)又多是具有生物傳染源性質(zhì)，所以在其生產(chǎn)、銷(xiāo)售及之后的處理過(guò)程中，要受到嚴(yán)密的評(píng)估和監(jiān)管，以其保證生物制品的安全性和有效性。這

2、些評(píng)估體系包括為達(dá)到生物制品的質(zhì)量要求所采取的計(jì)劃、監(jiān)測(cè)及校正等作業(yè)技術(shù)和活動(dòng)，即質(zhì)量控制。質(zhì)量控制主要包括原材料的生物安全性評(píng)估，生物制品純化過(guò)程的反應(yīng)活性及殘留污染物檢測(cè)等。生物制品的殘留物質(zhì)中的殘留蛋白包括真核宿主細(xì)胞蛋白、原核宿主細(xì)胞（如大腸桿菌）蛋白、雞胚來(lái)源蛋白、培養(yǎng)介質(zhì)中血清蛋白成分（如牛血清白蛋白）等。在國(guó)外許多公司和研究機(jī)構(gòu)采取多種方法來(lái)減少這些殘留蛋白成分從而進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)采取了高度敏感可靠的方法對(duì)這些質(zhì)量控制的

3、結(jié)果實(shí)施檢測(cè)。近年，我國(guó)也對(duì)這些殘留蛋白在生物制品中殘留量的上限進(jìn)行了規(guī)定，但是相關(guān)研究工作與國(guó)外比較相對(duì)滯后，現(xiàn)有許多檢測(cè)方法水平較低，難以滿足科研及市場(chǎng)發(fā)展需要。
　　本研究的第一部分采用大腸桿菌菌體蛋白免疫家兔，制備得到抗菌體蛋白兔多克隆抗體。應(yīng)用飽和硫酸銨、陰離子交換柱層析和親和層析方法純化的兔抗大腸桿菌菌體蛋白多克隆抗體，純化后標(biāo)記生物素，并經(jīng)親和素放大系統(tǒng)放大。在國(guó)內(nèi)首次建立了親和層析方法純化的兔抗大腸桿菌菌體蛋白多克

4、隆抗體檢測(cè)大腸桿菌菌體蛋白的ELISA方法，敏感性為0.32μg/L，檢測(cè)范圍在1-100μg/L，批內(nèi)CV小于7.7％，批間CV小于6.2％，具有良好的穩(wěn)定性，敏感性與檢測(cè)范圍與國(guó)際同類商品化檢測(cè)試劑盒接近。此外，本實(shí)驗(yàn)還采用大腸桿菌菌體蛋白免疫小鼠并制備得到抗菌體蛋白小鼠的單克隆抗體33株。經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定出抗大腸桿菌菌體蛋白成分中分子伴侶GroEL的單克隆抗體，并且抗體可以用來(lái)通過(guò)免疫沉淀的方法，從大腸桿菌菌體蛋白中分離出這一分子，

5、為進(jìn)一步研究分子伴侶GroEL的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的手段。
　　本研究第二部分是以牛血清白蛋白免疫小鼠，用含有馬血清的培養(yǎng)基制備得到抗牛血清白蛋白的小鼠單克隆抗體11株，經(jīng)飽和硫酸銨和陰離子交換層析純化后標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（HRP），通過(guò)夾心配對(duì)ELISA法篩選出夾心ELISA最佳包被和檢測(cè)抗體，在國(guó)內(nèi)首先建立了以單克隆抗體檢測(cè)牛血清白蛋白的夾心ELISA方法，敏感性為0.38μg/L，檢測(cè)范圍在0.5-40μg/L，批內(nèi)和批間變

6、異系數(shù)均小于10％。采用這一方法檢測(cè)牛血清白蛋白，比國(guó)外單克隆抗體試劑盒敏感高10倍，與國(guó)外多克隆抗體試劑盒相當(dāng)。
　　總之，本研究成功制備了抗牛血清白蛋白的單克隆抗體和抗大腸桿菌菌體蛋白多克隆抗體，建立了檢測(cè)牛血清白蛋白的基于單克隆抗體的夾心ELISA方法和檢測(cè)大腸桿菌菌體蛋白的親和層析多克隆抗體夾心ELISA方法，鑒定了大腸桿菌菌體蛋白成分GroEL單克隆抗體的部分用途，為進(jìn)一步檢測(cè)生物制品中殘留蛋白的質(zhì)量控制和相關(guān)研究打下扎