黃曲霉在不同飼料原料中產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的差異性及其可能機(jī)制.pdf

1、諸多調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在相同的溫度條件下，飼料原料中水分含量都處于安全水分以下時(shí)，不同飼料原料中黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)的污染程度依然各不相同，例如，玉米和花生粕相比于小麥和豆粕更容易被AF污染。了解不同飼料原料中AF污染差異形成的原因，可以為飼料生產(chǎn)中AF污染的防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。因此本研究根據(jù)不同飼料原料營(yíng)養(yǎng)成分組成的差異，研究不同營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響及其作用機(jī)制，從而闡明不同飼料原料中黃曲霉毒素B1(Af

2、latoxinB1，AFB1)污染差異性的原因。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.油脂對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)生AFB1的影響及其可能的作用機(jī)制
　　本試驗(yàn)選擇飼料原料:小麥、玉米、大豆、花生、大豆粕、花生粕、玉米胚乳和玉米胚作為試驗(yàn)材料。在未脫脂和脫脂的飼料樣品中分別接種黃曲霉孢子液，并且在脫脂飼料樣品中添加10％的不同油脂（玉米油、大豆油、花生油和小麥胚芽油）后接種黃曲霉孢子液，于30℃培養(yǎng)15d。研究不同飼料樣品中AFB1的積累情況

3、以及不同油脂在不同脫脂飼料樣品中對(duì)黃曲霉產(chǎn)生AFB1的影響。其次，在人工合成培養(yǎng)基中添加0.5％-8.0％的玉米油、大豆油、花生油和小麥胚芽油，進(jìn)一步研究不同油脂對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)和合成AFB1的影響，并測(cè)定AFB1合成中關(guān)鍵基因及蛋白的表達(dá)量。
　　1)不同原料中AFB1的積累情況及不同油脂在脫脂原料樣品中對(duì)黃曲霉合成AFB1的影響。粗脂肪含量高的原料如大豆、玉米胚和花生中AFB1的含量較高，且脫脂樣品中AFB1的含量要明顯低于未脫脂

4、的樣品，但是在脫脂樣品中添加10％的玉米油能恢復(fù)脫脂樣品對(duì)AFB1合成的促進(jìn)作用。在不同脫脂樣品中分別添加10％的玉米油、花生油、大豆油、小麥胚芽油發(fā)現(xiàn)，花生油對(duì)黃曲霉產(chǎn)AFB1的促進(jìn)作用最強(qiáng)，小麥胚芽油的作用相對(duì)較弱。但是在不同脫脂樣品中添加同一種油脂，原料中AFB1的含量各不相同。以上結(jié)果說明，油脂含量可能是造成不同原料AFB1污染差異的主要原因之一，且油脂種類對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒也有一定的影響;此外，除了油脂，原料基質(zhì)中其它成分也對(duì)黃曲霉

5、產(chǎn)毒有較大影響。
　　2)四種油脂在培養(yǎng)基中對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的影響。結(jié)果顯示，AFB1的產(chǎn)量隨著油脂添加量的增加而增加，當(dāng)油脂的添加量≥1.0％時(shí)，花生油的促進(jìn)作用最明顯(P＜0.05)，其次，玉米油＞大豆油＞小麥胚芽油。油脂均能促進(jìn)黃曲霉菌落生長(zhǎng)，黃曲霉菌落直徑隨著油脂添加量的增加也明顯增加(P＜0.05)，其中花生油的促進(jìn)作用最強(qiáng)。4種油脂對(duì)黃曲霉產(chǎn)孢有一定的抑制作用，其中小麥胚芽油和大豆油的抑制作用最強(qiáng)?；ㄉ蛯?duì)黃曲霉孢子

6、萌發(fā)的促進(jìn)作用最明顯(P＜0.05)，但大豆油的影響相對(duì)較小（P≥0.05）。說明油脂對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒和黃曲霉菌落生長(zhǎng)的作用一致，但對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒與產(chǎn)孢的結(jié)果不一致。
　　3)四種油脂對(duì)AF合成過程中關(guān)鍵基因及蛋白表達(dá)的影響。本試驗(yàn)檢測(cè)了與AF合成相關(guān)的14個(gè)關(guān)鍵基因。結(jié)果表明，4種油脂均能明顯促進(jìn)基因aflR和aflS表達(dá)，其中花生油的作用最顯著，其次是小麥胚芽油＞玉米油＞大豆油。同時(shí)，4種油脂均顯著上調(diào)AF合成通路前段基因aflC和

7、aflD(P＜0.05)的表達(dá)。AF合成后段的基因aflO、aflQ和調(diào)節(jié)基因aflU在玉米油組和花生油組中明顯上調(diào)(P＜0.05)，而在其它兩組中無顯著差異。
　　本試驗(yàn)應(yīng)用iTRAQ技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，花生油、玉米油、大豆油和小麥胚芽油與對(duì)照組相比，差異蛋白分別有298個(gè)、236個(gè)、231個(gè)和168個(gè);其中上調(diào)蛋白分別有179個(gè)、88個(gè)、123個(gè)和86個(gè);下調(diào)蛋白分別有119個(gè)、148個(gè)、108個(gè)和82個(gè)。花生油對(duì)AF合成相關(guān)蛋白表

8、達(dá)的影響最大，共有7個(gè)差異蛋白，其中蛋白AflG、AflK、AflL、AflO、AflP和AflV顯著上調(diào)(P＜0.05)，蛋白AflB顯著下調(diào)(P＜0.05)。大豆油的影響相對(duì)較小，有3個(gè)上調(diào)蛋白AflG、AflO和AflP。蛋白AflG、AflO和AflP在4種油脂中均顯著上調(diào)。說明，油脂可能是通過上調(diào)AF合成相關(guān)的關(guān)鍵基因與蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)黃曲霉合成AFB1。
　　2.不飽和脂肪酸對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)及合成AFB1的影響
　

9、　在培養(yǎng)基中分別添加0.005％-6.0％的單一不飽和脂肪酸:油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸;以及按照油酸、亞油酸和亞麻酸在4種天然油脂中的比例配制成的4種混合脂肪酸（添加量:0.5％、2.0％和8.0％），然后接種黃曲霉孢子液，于30℃培養(yǎng)7d。研究單一不飽和脂肪酸和脂肪酸配比對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)及合成AFB1的影響。
　　1)不飽和脂肪酸在培養(yǎng)基中對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)AFB1的影響。AFB1的產(chǎn)量隨著油酸、亞油酸和花生四烯酸添加量的增加

10、而增加，但是亞麻酸明顯抑制了黃曲霉合成AFB1。4種脂肪酸均可促進(jìn)黃曲霉菌落生長(zhǎng)，其中亞麻酸的促進(jìn)作用最明顯。亞麻酸的添加量?jī)H在0.5％以下時(shí)對(duì)黃曲霉產(chǎn)孢有一定的促進(jìn)作用，其它3種脂肪酸影響較小。亞油酸和亞麻酸對(duì)黃曲霉孢子萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用(P＜0.05)，0.05％和0.2％的油酸可以促進(jìn)黃曲霉孢子萌發(fā)，但當(dāng)油酸的添加量進(jìn)一步增加，明顯抑制了黃曲霉孢子萌發(fā)(P＜0.05)，花生四烯酸明顯抑制了黃曲霉孢子萌發(fā)(P＜0.05)。

11、　　2)混合脂肪酸對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)生AFB1的影響。按照花生油和玉米油配比的混合脂肪酸在添加量為0.5％和2.0％時(shí)，能促進(jìn)AFB1合成;按大豆油配比的2.0％和8.0％混合脂肪酸能抑制黃曲霉產(chǎn)AFB1;按小麥胚芽油配制的混合脂肪酸明顯抑制了AFB1合成。按小麥胚芽油配比的脂肪酸明顯促進(jìn)了黃曲霉菌落生長(zhǎng)，而按花生油配比的脂肪酸對(duì)黃曲霉菌落生長(zhǎng)無明顯影響。當(dāng)添加量達(dá)到8.0％時(shí)，4種配比混合脂肪酸顯著抑制了黃曲霉孢子的產(chǎn)生（P＜0.05）

12、。
　　以上結(jié)果說明，油脂中不飽和脂肪酸的種類和含量可能是造成不同油脂對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒及生長(zhǎng)影響不同的主要因素。
　　3.飼料原料基質(zhì)中不同成分對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)及合成AFB1的影響及其可能的作用機(jī)制
　　在液體培養(yǎng)基中分別添加淀粉（添加量為:0.5％-5.0％）、可溶性糖（蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、棉子糖和水蘇糖的添加量為:0.5％、1.0％、3.0％和6.0％）、氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸和甘氨酸的添加量為:

13、0.5％、1.0％和2.0％）和微量元素（銅，5mg/L-50mg/L;鐵，20mg/L-200mg/L;鋅，20mg/L-100mg/L;錳，10mg/L-100mg/L），接種黃曲霉孢子液，30℃培養(yǎng)3d-5d，研究它們對(duì)黃曲霉合成AFB1、生長(zhǎng)以及AFB1合成中關(guān)鍵基因（afR、aflS、aflD、aflM和aflP）表達(dá)量的影響。
　　1)淀粉和可溶性糖的影響。淀粉作為唯一碳源時(shí)，不利于黃曲霉合成AFB1。當(dāng)可溶性糖的添加

14、量從1.0％增加到3.0％后，AFB1的合成量急劇增加（果糖除外），麥芽糖和蔗糖的作用最明顯，其次是葡萄糖和水蘇糖，而果糖和棉子糖對(duì)AFB1合成促進(jìn)作用相對(duì)較弱。隨著可溶性糖添加量增加，均能明顯促進(jìn)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)，其中水蘇糖的作用最顯著(P＜0.05)。相比于1.0％的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水蘇糖，3.0％的可溶性糖均能明顯促進(jìn)aflS、aflD、aflM和aflP基因表達(dá)，且葡萄糖(P＜0.01)和水蘇糖（P＜0.001）也能促進(jìn)了a

15、flR基因的表達(dá)。說明飼料原料中可溶性糖含量越高，越容易被AFB1污染。
　　2)氨基酸的影響。當(dāng)氨基酸的添加量為0.5％時(shí)，谷氨酸明顯促進(jìn)AFB1合成，其次是天冬氨酸和精氨酸，丙氨酸和甘氨酸的作用相對(duì)較弱。隨著天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和丙氨酸添加量的增加能顯著促進(jìn)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)(P＜0.05)。天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸都可以不同程度地促進(jìn)關(guān)鍵基因flR、aflS、aflD、aflM和aflP的表達(dá)。說明飼料原料中谷氨酸、天冬氨酸

16、和精氨酸的含量對(duì)黃曲霉的產(chǎn)毒和生長(zhǎng)有很大的影響。
　　3)微量元素的影響。4種微量元素中銅、鐵和錳對(duì)黃曲霉合成AFB1有明顯的抑制作用(P＜0.05)，但鋅能顯著促進(jìn)AFB1合成(P＜0.05)。在4種微量元素中，銅明顯抑制了黃曲霉菌絲生長(zhǎng)（P＜0.05），而鋅、鐵和錳均能促進(jìn)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)3d時(shí)，鋅能夠顯著地促進(jìn)基因aflR、aflS、aflD、aflM和aflP的表達(dá)(P＜0.001);在培養(yǎng)5d時(shí)，銅明顯抑制了這5個(gè)

17、關(guān)鍵基因的表達(dá)。說明，飼料原料中鋅的含量越高，越有利于黃曲霉產(chǎn)毒。
　　綜上所述，本研究得出以下結(jié)論:1）原料中油脂是影響黃曲霉產(chǎn)生AFB1的重要因素，其中花生油對(duì)黃曲霉合成AFB1和生長(zhǎng)的影響最大。2）油脂中不飽和脂肪酸的種類及含量，可能是不同油脂對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒和生長(zhǎng)的影響存在差異的主要原因。3)天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、水蘇糖和鋅能夠明顯地刺激AFB1產(chǎn)生，而淀粉、銅、鐵和錳不利于黃曲霉產(chǎn)生AFB1。4）不