脫落酸、玉米素對人SACC-2細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 誘導(dǎo)分化概念的提出，改變了20世紀(jì)50年代曾流行的“一旦成為癌細(xì)胞，便永遠(yuǎn)是癌細(xì)胞”的觀點(diǎn)。尋求應(yīng)用高效低毒的誘導(dǎo)分化劑是這一策略的核心和目標(biāo)。其意義旨在誘導(dǎo)分化劑的作用下，誘導(dǎo)幼稚的腫瘤細(xì)胞向成熟階段分化，恢復(fù)或接近正常細(xì)胞的表型與功能。 涎腺腺樣囊性癌(Salivary adenoid cystic cell carcinoma SACC)在唾液腺惡性腫瘤中居首位，與其他腫瘤相比，該腫瘤具有侵襲性強(qiáng)、浸潤性

2、生長、早期易沿神經(jīng)血管束向遠(yuǎn)處擴(kuò)展和轉(zhuǎn)移等特征。目前臨床對于SACC的治療仍以手術(shù)切除為主，但手術(shù)治療難以徹底切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，且對放療不敏感，傳統(tǒng)的化療藥物效果不顯著，因此，如何根治SACC是一直困擾醫(yī)學(xué)界的難題，故探索更為有效的新療法已成為SACC治療最迫切的課題。利用從植物中提取的有效成分抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)分化以促進(jìn)其凋亡成為目前研究的熱點(diǎn)之一。脫落酸(abscisic acidABA)、玉米素(zeatinZT)作為植

3、物中重要的生長調(diào)節(jié)激素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上和功能上與維甲酸極為相似，抗腫瘤作用的研究國內(nèi)外文獻(xiàn)相繼有報(bào)道，而對腺樣囊性癌作用的研究未見報(bào)道。因此，本課題選用ABA、ZT誘導(dǎo)分化后對SACC-2細(xì)胞的形態(tài)、生長抑制、超微結(jié)構(gòu)、相關(guān)蛋白表達(dá)等方面變化的研究，探討ABA、ZT對SACC-2增殖和誘導(dǎo)分化方面的影響及可能的作用機(jī)制。 目的 觀察天然植物激素ABA、ZT作用SACC-2癌細(xì)胞后，對SACC-2細(xì)胞抑制增殖的影響、促進(jìn)誘導(dǎo)

4、分化作用機(jī)制與凋亡的關(guān)系，及其與時問、濃度、劑量的相關(guān)性，為其治療涎腺腺樣囊性癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 方法；1采用MTT比色法、光學(xué)顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)從細(xì)胞增殖活力、DNA合成和周期分布等方面研究植物激素ABA、ZT對SACC-2細(xì)胞增殖的影響。 2采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)分化標(biāo)志物RAR α和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，探討天然植物激素ABA、ZT影響SACC-2細(xì)胞誘導(dǎo)分化的分子生物學(xué)作用機(jī)制。

5、 3采用凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察、流式細(xì)胞術(shù)等手段，從形態(tài)學(xué)、亞二倍體細(xì)胞比例和細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)等方面研究植物激素ABA、ZT。對SACC-2細(xì)胞凋亡的影響。 4采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)觀察ABA和ZT植物激素對核增殖抗原PCNA、CDK<,2>抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白：Bax表達(dá)的影響，探討其影響細(xì)胞增殖和凋亡的分子生物學(xué)作用機(jī)制。 結(jié)果 1對細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化的影響(1)ABA

6、具有較強(qiáng)的抑制SACC-2癌細(xì)胞生長作用，在1×10<'-1>mmol/L濃度下即可產(chǎn)生誘導(dǎo)分化效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞存在向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化趨勢。ZT在相同條件下比ABA較弱(P<0.05)。但兩種植物激素在一定的劑量范圍內(nèi)均能抑制SACC-2細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)出良好的劑量一效應(yīng)和時間．效應(yīng)關(guān)系。 (2)不同濃度的ABA和ZT對SACC-2細(xì)胞增殖的影響不同。在≤1×10<'-1>mmol/L的濃度12h范圍內(nèi)，ABA和ZT均有不同程度的促

7、進(jìn)SACC-2細(xì)胞增殖作用，隨時間推移，逐漸呈現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖作用。 2對細(xì)胞凋亡的影響SACC-2細(xì)胞在天然植物激素作用條件下，均出現(xiàn)典型的凋亡特征(凋亡小體的形成、亞二倍體細(xì)胞比值升高等)，表明SACC-2細(xì)胞株對ABA、ZT植物激素的反應(yīng)是敏感的。電鏡下可觀察到處于各個凋亡期的細(xì)胞，凋亡細(xì)胞特有凋亡小體出現(xiàn)。溶劑對照組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象不明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3對維甲酸受體α蛋白表達(dá)的影響免疫細(xì)胞化學(xué)

8、結(jié)果顯示，在ABA、ZT 1×10<'1->mmol/L濃度下與溶劑對照組相比，上調(diào)RXRα的表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 4對核增殖抗原PCNA、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響與溶劑對照組相比，ABA、ZT作用SACC-2細(xì)胞可下調(diào)PCNA的表達(dá)，調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)比例而抑制SACC-2細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 5對CDK<,2>、Cyclin D

9、<,1>、P27蛋白表達(dá)的影響ABA和ZT使SACC-2細(xì)胞Cyclin D1、CDK<,2>表達(dá)下降，p27蛋白表達(dá)升高，從而抑制CyclinD-CDK<,4>、CyclinE-CDK<,2>復(fù)合物的形成，并且p27有效地與cyclinD-CDK<,4>、CyclinE-CDK<,2>復(fù)合物結(jié)合，抑制cyclin E-CDK<,2>和cyclin D-CDK<,4>等G<,1>期激酶復(fù)合物，阻止細(xì)胞通過G<,1>/S期檢查點(diǎn)，使細(xì)胞阻

10、滯于G1期。G<,0>/G<,1>期細(xì)胞構(gòu)成比分別為80.13％和77.23％，G<,2>/M期細(xì)胞構(gòu)成比分別為6.47％和7.64％，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 1植物激素ABA、ZT對SACC-2細(xì)胞的增殖和凋亡有不同程度的影響，并有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓幕蚪咏墒斓恼＜?xì)胞，恢復(fù)細(xì)胞的正常或接近正常的表型與功能。且存在較明顯的劑量-效應(yīng)及時間一效應(yīng)關(guān)系；可作為SACC-2的誘導(dǎo)分化

11、劑。 2 植物激素ABA、ZT在低濃度條件(≤1×10<'-1>mmol/L)下顯示促進(jìn)增殖作用，但在高劑量(≥1×10<'-1> mmol/L)下表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制增殖作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞分化、誘導(dǎo)凋亡，此結(jié)果提示ABA、ZT的生物活性具有雙向性。 3 ABA、ZT對SACC-2細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用可能通過上調(diào)RXRα蛋白的表達(dá)而作用的，它是誘導(dǎo)分化的重要機(jī)制之一。 4 ABA、ZT植物激素對SACC-2細(xì)胞增殖和凋亡

12、的影響是通過調(diào)節(jié)核增殖抗原PCNA、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。 5 ABA、ZT能使SACC-2的細(xì)胞周期停滯于G<,0>/G<,1>期，可能通過影響細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1以及細(xì)胞周期的調(diào)控因子CDK<,2>、P27蛋白表達(dá)下降，調(diào)控SACC-2的增殖分化，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，從而起到抗腫瘤的作用。 綜上所述本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、電鏡、免疫組化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，首次觀察到ABA、ZT