昆蟲核型多角體病毒的增效途徑和機(jī)理.pdf

1、昆蟲核型多角體病毒(NPV)作為生物殺蟲劑，除了具有對(duì)天敵安全、不污染環(huán)境和不易產(chǎn)生抗藥性等生物農(nóng)藥普遍存在的優(yōu)點(diǎn)外，更因其能在害蟲種群中形成流行病而長期控制蟲口這一明顯優(yōu)于其它殺蟲劑的特點(diǎn)而受到人們的廣泛關(guān)注。但NPV也存在殺蟲范圍窄和作用速度慢等缺點(diǎn)，這大大限制了其在生產(chǎn)上的應(yīng)用。因此，研究提高其殺蟲活性的途徑和機(jī)理對(duì)于開發(fā)實(shí)用性病毒制劑是至關(guān)重要的。 目前對(duì)NPV的增效途徑和增效機(jī)理已有不少研究報(bào)道，但斜紋夜蛾NPV(SI

2、NPV)尚很少研究。斜紋夜蛾和甜菜夜蛾食性雜，食量大，繁殖力強(qiáng)，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要害蟲，已對(duì)許多化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性，SINPV是具有潛力的替代生物防治劑。因此，本文以斜紋夜蛾和甜菜夜蛾為靶標(biāo)對(duì)象，研究提高SINPV毒力的增效途徑和增效機(jī)理，以促進(jìn)SINPV在害蟲防治上的開發(fā)應(yīng)用。 一、核型多角體病毒增效途徑研究本研究通過測(cè)定不同病毒種和分離株之間復(fù)合侵染的增毒作用、交替感染不同寄主對(duì)毒力的影響、以及生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑對(duì)病毒的增效

3、作用，尋找提高NPV毒力效果的途徑。研究結(jié)果如下： (1)不同種病毒間的聯(lián)合增效作用研究表明，八字地老虎顆粒體病毒(XcGV)可明顯提高核型多角體病毒(NPV)的毒力。在以斜紋夜蛾為靶標(biāo)對(duì)象時(shí)，XcGV可提高斜紋夜蛾NPV(SINPV)對(duì)3齡幼蟲的殺蟲速度，害蟲的致死中時(shí)間(LT50)縮短了0.5-2.5d，還可同時(shí)提高SINPV對(duì)5齡幼蟲的殺蟲速度和殺蟲活性，害蟲的死亡率提高了33.8％；此外，聯(lián)合作用于5齡幼蟲時(shí)還明顯抑制了

4、斜紋夜蛾體重的增長。以甜菜夜蛾為靶標(biāo)對(duì)象時(shí)，XcGV可提高XcNPV和SINPV對(duì)2齡幼蟲的殺蟲速度，LT50縮短1.3-1.7d。 (2)SINPV不同分離株間的增效作用研究發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾核型多角體病毒(SINPV)日本福岡株、小笠原株和埃及株感染斜紋夜蛾，在種群中連續(xù)傳代的過程中，各分離株單獨(dú)及復(fù)合侵染對(duì)斜紋夜蛾的毒力均發(fā)生了明顯變化。單獨(dú)侵染連續(xù)傳代后，各分離株毒力顯著提高，但不同分離株毒力提高的程度不同。F0代時(shí)以福岡株

5、的毒力最高，埃及株次之，小笠原株最低，在F1代，以小笠原株毒力最高，福岡株次之，埃及株最低，而在F2代，小笠原株和埃及株的毒力變得高于福岡株，但到F3代，3個(gè)分離株的毒力無顯著差異。復(fù)合侵染連續(xù)傳代時(shí)，在F0代和F1代日本福岡株和小笠原株以及小笠原株和埃及株兩兩復(fù)合侵染均顯著增效，但福岡株和埃及株間以及三個(gè)分離株同時(shí)復(fù)合侵染均具有拮抗作用，在F2代和F3代，除F2代時(shí)小笠原株和埃及株外，其余各復(fù)合侵染也均具有拮抗作用。 (3)宿

6、主對(duì)病毒毒力效果的影響選用對(duì)甜菜夜蛾較?；能俎ｃy紋夜蛾NPV(AcNPV)和對(duì)斜紋夜蛾較?；腟INPV，研究了混合病毒在不同宿主中交替繁殖對(duì)病毒毒力的影響。兩種病毒以1∶1混合后，分別連續(xù)感染或交替感染甜菜夜蛾和斜紋夜蛾，比較測(cè)定各代病毒對(duì)甜菜夜蛾和斜紋夜蛾的活性，結(jié)果表明，SINPV中國株和AcNPV混合，起始感染甜菜夜蛾，再在斜紋夜蛾和甜菜夜蛾中交替繁殖后，F(xiàn)4代從斜紋夜蛾中分離的病毒對(duì)3齡甜菜夜蛾幼蟲的致死率極顯著高于F2代斜

7、紋夜蛾中分離的病毒，F(xiàn)3代從甜菜夜蛾中分離的病毒對(duì)斜紋夜蛾的致死率也顯著高于F1代甜菜夜蛾中分離的病毒。起始感染斜紋夜蛾，經(jīng)甜菜夜蛾和斜紋夜蛾中交替繁殖后，斜紋夜蛾中分離的病毒對(duì)甜菜夜蛾的毒力以及甜菜夜蛾中分離的病毒對(duì)斜紋夜蛾的毒力也都顯著提高。同時(shí)，交替寄主傳代后的病毒比同代次同種寄主連續(xù)傳代后的病毒對(duì)非宿主的毒力顯著提高，并且它們對(duì)原宿主的毒力未有減弱。AcNPV和SINPV日本株混合病毒在甜菜夜蛾和斜紋夜蛾中交替繁殖后也表現(xiàn)出對(duì)非

8、宿主毒力的提高。這表明混合病毒在不同宿主中交替繁殖比其在同種宿主中連續(xù)繁殖后對(duì)非繁殖原宿主的毒力提高。 (4)米滿和氟啶脲對(duì)病毒的增效作用研究證明昆蟲幾丁質(zhì)合成抑制劑氟啶脲對(duì)NPV有顯著增效作用。氟啶脲和AcNPV聯(lián)合作用時(shí)，可提高病毒對(duì)3齡幼蟲的殺蟲活性和殺蟲速度，對(duì)害蟲的致死中濃度(LC50)和LT50分別下降83％和11％。氟啶脲和AcNPV聯(lián)合作用還顯著抑制了甜菜夜蛾幼蟲的生長發(fā)育，幼蟲體重增長明顯低于單用病毒處理的幼蟲

9、。氟啶脲和SINPV聯(lián)合作用于5齡斜紋夜蛾幼蟲時(shí)，病毒的殺蟲活性和殺蟲速度分別提高了139.8％和5％。 昆蟲蛻皮激素拮抗劑米滿對(duì)AcNPV增效作用的測(cè)定結(jié)果表明，米滿可顯著提高AcNPV對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲毒力和殺蟲速度。作用于3齡和4齡幼蟲時(shí)，6.67mg/L米滿對(duì)AcNPV的增效比分別是1.31和3.62，使害蟲LT50分別縮短25％和20.4％。米滿和病毒協(xié)同作用還顯著抑制了幼蟲的生長發(fā)育，在協(xié)同作用1天后，幼蟲體重即顯著低

10、于單用病毒或?qū)φ仗幚淼挠紫x，并且隨著作用時(shí)間的延長，協(xié)同作用組幼蟲體重同病毒單劑組及對(duì)照組的差異越來越大。但6.67mg/L米滿和2.7×105PIB/mlAcNPV協(xié)同作用于幼蟲期時(shí)，其對(duì)存活幼蟲發(fā)育為成蟲后的繁殖力無影響，成蟲產(chǎn)卵量、交配率、卵孵率以及卵孵化幼蟲數(shù)等均與病毒單劑、米滿單劑和對(duì)照無顯著差異。 二、病毒增效機(jī)理研究本研究通過靶標(biāo)試蟲的組織觀察和病毒基因組DNA分析，對(duì)病毒不同增效途徑的機(jī)理進(jìn)行了研究，結(jié)果如下：

11、 (1)病毒增效作用與昆蟲圍食膜破壞的關(guān)系通過環(huán)境掃描電鏡(ESEM)觀察了XcGV在活體中對(duì)斜紋夜蛾圍食膜結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，正常的斜紋夜蛾圍食膜表面光滑、致密，除細(xì)小的皺褶外，沒有孔和裂紋；SINPV單獨(dú)作用后圍食膜表面凹凸不平，但仍較為致密，并且也沒有孔隙和裂紋；而XcGV在活體內(nèi)單獨(dú)作用2h后圍食膜結(jié)構(gòu)變得疏松，在XcGV和SINPV協(xié)同作用2h后，圍食膜表面亦變得疏松，并且出現(xiàn)一些孔隙和縫。說明XcGV破壞了昆蟲圍食膜

12、，使其對(duì)NPV的通透性增加，從而提高了SINPV的侵染力。由此表明XcGV對(duì)昆蟲圍食膜的破壞作用是其對(duì)NPV增效的重要機(jī)理。 環(huán)境掃描電鏡觀察結(jié)果還表明，昆蟲生長調(diào)節(jié)劑氟啶脲也對(duì)斜紋夜蛾圍食膜產(chǎn)生了強(qiáng)烈的破壞作用。2.5mg/L的氟啶脲處理2h后，斜紋夜蛾5齡幼蟲的圍食膜出現(xiàn)明顯的裂縫，混合處理組斜紋夜蛾也出現(xiàn)裂縫，并且有許多孔洞。表明氟啶脲對(duì)斜紋夜蛾核多角體的增效作用與其對(duì)昆蟲圍食膜的破壞作用有關(guān)。進(jìn)一步研究圍食膜的幾丁質(zhì)含量

13、，發(fā)現(xiàn)氟啶脲和NPV聯(lián)合作用后，斜紋夜蛾圍食膜幾丁質(zhì)的含量極顯著下降，表明氟啶脲對(duì)NPV的增效作用是由于其對(duì)圍食膜幾丁質(zhì)的破壞作用引起的。 病毒增效作用與昆蟲病毒基因型的關(guān)系通過活體克隆法研究分析了SINPV各分離株F0代病毒基因型。在獲得了低劑量下感染SINPV日本福岡株、日本小笠原株和埃及株F0代病毒的斜紋夜蛾病蟲后，分離病毒，比較各單頭病蟲中病毒對(duì)斜紋夜蛾和甜菜夜蛾的毒力，并對(duì)病毒的基因型進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個(gè)分離株感染

14、后，單頭病蟲中分離的病毒均存在表型差異，不僅對(duì)斜紋夜蛾的侵染力不同，而且侵染速度也有差異，侵染力和侵染速度間無明顯相關(guān)性，另外各病毒對(duì)甜菜夜蛾的毒力也存在差異。 本研究還表明，SINPV和AcNPV混合在甜菜夜蛾和斜紋夜蛾中交替繁殖后，病毒毒力提高與病毒基因型的變異相關(guān)。SINPV中國株和AcNPV中國株以1∶1混合感染斜紋夜蛾后，再經(jīng)甜菜夜蛾和斜紋夜蛾中交替繁殖1次，最終由斜紋夜蛾中獲得的病毒DNA酶切圖譜較連續(xù)在斜紋夜蛾中繁

15、殖的病毒酶切圖譜發(fā)生了變化，而一直在斜紋夜蛾中連續(xù)傳代的各代次病毒酶切圖譜未有變化。SINPV日本福岡株和AcNPV中國株混合感染甜菜夜蛾后，再感染斜紋夜蛾，得到的斜紋夜蛾病毒再交替感染甜菜夜蛾和斜紋夜蛾，亦發(fā)現(xiàn)交替繁殖2次后從斜紋夜蛾中分離的病毒限制性酶切圖譜較交替繁殖1次后的病毒酶切圖譜有變化。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)XcGV對(duì)SINPV、以及具有基因型差異的SINPV分離株之間，具有明顯的增毒作用；甜菜夜蛾和斜紋夜蛾等不同宿

16、主的交叉感染可以拓展病毒的有效防治靶標(biāo)范圍；昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑氟啶脲和米滿，對(duì)SINPV也有明顯的增效作用。其中GV和氟啶脲對(duì)NPV的增效作用機(jī)制，主要是他們可以破壞斜紋夜蛾幼蟲的圍食膜；而不同分離株之間的增效作用則可能與不同基因型之間的互補(bǔ)效應(yīng)有關(guān)；交替感染不同宿主提高病毒對(duì)不同宿主毒力的主要原因，可能是由于病毒在交替感染過程中的基因型變異造成的。 本研究發(fā)現(xiàn)的病毒增效途徑，可以用于開發(fā)高效的病毒制劑，研究揭示的增效機(jī)理，