槲皮素、異土木香內酯和土木香內酯的結構修飾研究.pdf

1、第一部分槲皮素的結構修飾及活性評價
　　槲皮素是一種分布最廣泛的黃酮類化合物，約有100多種植物中含有槲皮素。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有廣泛的藥理作用和生物活性，如抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒及鎮(zhèn)痛作用等，因此對槲皮素及其衍生物的生物活性研究越來越受到關注。然而槲皮素脂溶性較差、生物利用度較低，使其開發(fā)利用受到了限制。槲皮素-O-甲基化衍生物是在體內代謝的中間體并被認為是最有生物活性的結構，所以對槲皮素進行甲基化修飾及活性研究具有相當重要的

2、意義。
　　目的:以槲皮素為研究對象，通過直接甲基化和先用保護基對槲皮素的羥基進行保護，然后再甲基化兩種途徑，獲取槲皮素甲基化衍生物，用1H NMR、13C NMR、HSQC和HMBC等鑒定化合物結構，對結構修飾的產物進行抗肝癌活性篩選，為發(fā)現(xiàn)新的藥物先導化合物做出一些基礎研究工作。
　　方法:將精制后的槲皮素和適量的DMF置于三口燒瓶中，加入適量的無水碳酸鉀，室溫攪拌10 min后加入甲基化試劑碘甲烷，在室溫或0℃反應，T

3、LC監(jiān)測至反應結束，用稀鹽酸將反應液調至中性，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，水洗，無水硫酸鈉干燥過夜，旋蒸除去溶劑，殘液用硅膠柱色譜進行分離，根據(jù)反應溫度和反應物投料比的不同，可得單甲基槲皮素至四甲基槲皮素。將槲皮素溶于DMF中，加入適量的無水碳酸鉀，室溫攪拌10 min后加入芐基化試劑氯化芐，60℃反應，TLC監(jiān)測至反應結束，用稀鹽酸將反應液調至中性，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，水洗，無水硫酸鈉干燥過夜，旋蒸除去溶劑，殘液用硅膠柱色

4、譜進行分離，根據(jù)反應溫度和氯化芐用量的不同，可主要得三芐基槲皮素和四芐基槲皮素，然后再用甲基化試劑碘甲烷對芐基槲皮素分別進行甲基化。用二氯二苯甲烷對槲皮素的鄰二酚羥基進行保護，然后再用甲基化試劑碘甲烷對其進行甲基化。產物應用ESI-MS、1H NMR鑒定化合物的結構、部分化合物經13C NMR、HSQC和HMBC等鑒定結構。
　　結果:不用保護基，直接用碘甲烷對槲皮素進行甲基化，室溫條件下反應主要得3，7，3'，4'-O-四甲基槲

5、皮素(2a)和3，7，4'-O-三甲基槲皮素(2b)，0℃反應，主要得7，4'-O-二甲基槲皮素(2c)、3，7-O-二甲基槲皮素(2d)和3-O-甲基槲皮素(2e)。用氯化芐對槲皮素的羥基進行保護，在70℃、氯化芐是槲皮素的5倍（摩爾數(shù)）時，主要得四芐基槲皮素(3b);在60℃、氯化芐是槲皮素的3倍（摩爾數(shù)）時，主要得三芐基槲皮素(3a);用碘甲烷分別對三芐基槲皮素和四芐基槲皮素進行甲基化反應，得到了三芐基甲基槲皮素(4a)，而未能得

6、到四芐基甲基槲皮素(4b)。用二氯二苯甲烷對槲皮素的鄰二酚羥基進行保護得化合物5，由于5的收率太低，而未對其進行甲基化反應。
　　結論:本研究對槲皮素進行了結構修飾，直接用碘甲烷和槲皮素反應，在不同的溫度及投料比條件下，共得到5個槲皮素甲基化衍生物;先將槲皮素的羥基保護起來，然后再進行甲基反應的實驗方案和直接甲基化的實驗方案相比，反應步驟多，分離提純困難、收率低?？垢伟┗钚詫嶒灲Y果表明，槲皮素的甲基化程度越高，抗肝癌細胞（人肝癌細

7、胞株Bel-7402、人肝癌細胞株Hep G2、大鼠肝癌細胞株SMMC-7721）增殖能力越弱。
　　第二部分土木香的提取分離
　　目的:以中藥材土木香根為研究對象，利用硅膠柱色譜、硝酸銀硅膠柱色譜等分離技術對其進行分離，獲得異土木香內酯和土木香內酯單體化合物，用1H NMR鑒定化合物結構，為下一步的結構修飾奠定物質基礎。
　　方法:取粉碎后的藥材約5 Kg，用99％乙醇加熱回流2小時提取3次，合并濾液，除去溶劑得浸膏

8、，即土木香根的粗提物，約600 g。將得到的土木香浸膏分散于氯化鈉飽和水溶液中，依次用石油醚、二氯甲烷進行萃取，得石油醚提取物浸膏約135 g、二氯甲烷提取物浸膏約70 g。采用硅膠柱色譜、硝酸銀硅膠柱色譜對以上部兩種浸膏進行分離可得異土木香內酯和土木香內酯兩個化合物，用1H NMR對化合物的結構進行鑒定。
　　結果:通過乙醇提取、石油醚和二氯甲烷萃取和柱色譜等步驟從土木香根中分離得到異土木香內酯和土木香內酯兩個化合物，為下一步的

9、結構修飾奠定了物質基礎。
　　結論:本研究主要是從土木香根中提取其主要活性成分異土木香內酯和土木香內酯，經過乙醇提取、石油醚和二氯甲烷萃取、柱色譜分離等步步驟可以得到異土木香內酯和土木香內酯。
　　第三部分異土木香內酯的結構修飾—Heck反應
　　目的:以異土木香內酯為研究對象，通過Heck反應對其進行結構修飾，通過1H NMR數(shù)據(jù)對化合物的結構進行鑒定。對結構修飾的產物進行抗肝癌活性篩選，為發(fā)現(xiàn)新的藥物先導化合物做出

10、一些基礎研究工作。
　　方法:在醋酸鈀和三（鄰甲苯基）膦的催化下和三乙胺的存在下，在DMF溶液中加入碘代芳烴對異土木香內酯進行結構修飾，120℃加熱反應10-12 h，反應完畢后用乙酸乙酯萃取，最后通過硅膠柱色譜進行分離純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(15:1)。用MTT法測定異土木香內酯衍生物3a-3d對三種肝癌細胞的抑制活性。
　　結果:優(yōu)化了Heck反應的合成條件:醋酸鈀和三（鄰甲苯基）膦是最佳的催化體系，溫度120℃

11、反應10-12h。反應物萃取之后用硅膠柱層析法進行分離純化，得對氯苯異土木香內酯(9a)、對苯異土木香內酯(9b)、對甲苯異土木香內酯(9c)和對甲氧基苯異土木香內酯(9d)4個化合物，收率60-91％。
　　結論:本研究建立了用碘代芳烴對異土木香內酯進行結構修飾的方法，優(yōu)化了反應條件。用MTT法測定異土木香內酯衍生物9a-9d，對氯苯異土木香內酯(9a)和對甲氧基苯異土木香內酯(9d)對Hep G2腫瘤細胞的增殖抑制活性和紫杉醇

12、基本相同，優(yōu)于順鉑。
　　第四部分異土木香內酯的結構修飾—Michael加成反應
　　目的:以異土木香內酯為研究對象，用活性亞甲基化合物通過Michael加成反應對其進行結構修飾，產物通過1H NMR、13C NMR、HRMS進行結構鑒定。對結構修飾的產物進行抗肝癌活性篩選，為發(fā)現(xiàn)新的藥物先導化合物做出一些基礎研究工作。
　　方法:將活性亞甲基化合物溶于乙醇中，加入適量的堿催化劑后室溫攪拌，然后再加異土木香內酯，室溫攪

13、拌反應，TLC監(jiān)測反應進程，反應混合物調為中性用后乙酸乙酯萃取、然后通過硅膠柱色譜進行純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(15∶1)。用MTT法測定異土木香內酯衍生物11a-11g對三種肝癌細胞（人肝癌細胞株Bel-7402、人肝癌細胞株Hep G2、大鼠肝癌細胞株SMMC-7721）的抑制活性。
　　結果:以異土木香內酯為底物，用7種活性亞甲基化合物通過Michael加成反應對其進行結構修飾，共得到了7個異土木香內酯衍生物，即氰乙酸

14、甲酯異土木香內酯(11a)、氰乙酸乙酯異土木香內酯(11b)、丙二酸二甲酯異土木香內酯(11c)、丙二酸二乙酯異土木香內酯(11d)，硝基甲烷異土木香內酯(11e)、硝基乙烷異土木香內酯(11f)、乙酰乙酸乙酯異土木香內酯(11g)所有化合物經核磁氫譜、碳譜和高分辨質譜進行結構鑒定。以化合物11a和11c為例優(yōu)化了反應條件，目標化合物收率可達71～94％。
　　結論:本研究建立了用活性亞甲基化合物對異土木香內酯進行結構修飾的方法，

15、優(yōu)化了反應條件，合成了7個未見文獻報道的化合物11a-11g。用MTT法測定合成的7個異土木香內酯衍生物的抗肝癌活性，氰乙酸甲酯(11a)異土木香內酯和氰乙酸乙酯異土木香內酯(11b)對Hep G2腫瘤細胞增殖有一定的抑制作用，其抑制活性大于順鉑，小于紫杉醇。
　　第五部分土木香內酯的結構修飾—Michael加成反應
　　目的:以土木香內酯為研究對象，用活性亞甲基化合物通過Michael加成反應對其進行結構修飾，所合成的化合

16、物通過1HNMR、13C NMR對化合物的結構進行鑒定。
　　方法:將活性亞甲基化合物溶于乙醇中，加入適量的堿催化劑，室溫攪拌，然后再加土木香內酯，室溫攪拌反應，TLC監(jiān)測反應進程，反應混合物調為中性用后乙酸乙酯萃取、然后通過硅膠柱色譜進行純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(15:1)。
　　結果:以土木香內酯為底物，用活性亞甲基化合物通過Michael加成反應對其進行結構修飾，共得到了6個土木香內酯衍生物，即氰乙酸甲酯土木香內