EphB4-ephrinB2反向信號在血府逐瘀湯促血管新生中的作用研究.pdf

1、血管生成是在原有血管結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，由不同信號參與并刺激內(nèi)皮細胞增殖、遷移、粘附，甚至是誘導(dǎo)血管周圍細胞核胞外基質(zhì)重構(gòu)的多步驟過程。內(nèi)皮細胞受體酪氨酸激酶是調(diào)節(jié)血管新生的重要因素，其代表性家族成員血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和促血管生成素(angiopoietins)對血管新生的作用已得到證實并逐漸應(yīng)用于臨床。
　　 Eph是已知受體酪氨酸激酶家族(RTKs)中最大的亞家族，不同于其他RTKs成員同可溶性配體連接的特點，Eph通過

2、細胞接觸的形式同跨膜配體ephrin特異性結(jié)合。而配體ephrin主要發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞遷移和粘附的作用。Eph/ephrin之間互為配-受體，形成雙向信號，參與體內(nèi)多種生理過程的調(diào)節(jié)，研究較為廣泛的是其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。此外，還有不少研究指出，Eph/ephrin在血管新生過程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，尤其是EphB4和ephrinB2在動靜脈上的特異性分布
　　 以及配-受體相互作用形成的雙向信號，不僅調(diào)節(jié)胚胎期血管的發(fā)育，而且繼續(xù)影響

3、出生后血管新生。本課題組前期研究表明，血府逐瘀湯具有較好的促血管新生作用，且促血管新生作用與藥物濃度和作用時間呈倒U型關(guān)系，提示該藥具有促血管適度生長的作用，有別于VEGF等的一味促血管生成，避免出現(xiàn)血管過度生長。EphB4/ephrinB2在調(diào)節(jié)血管生成方面得到越來越多的肯定，而課題組應(yīng)用基因芯片技術(shù)觀察血府逐瘀湯對多種調(diào)控血管生成的因子的影響，檢測發(fā)現(xiàn)配體ephrinB2呈上調(diào)表達。血府逐瘀膠囊在保持了血府逐瘀湯原方配伍的基礎(chǔ)上，對

4、劑型稍做改變，服用更加方面，而且可控性強，是的實驗結(jié)果更客觀可信。本實驗用膠囊劑，目的在于探索血府逐瘀湯如何通過EphB4/ephrinB2信號通路促血管新生繼而發(fā)揮適度調(diào)控的作用。
　　 目的：
　　 通過觀察血府逐瘀含藥血清不同濃度(1.25％，2.5％，5％)下對體外成血管的影響，篩選出藥物促血管新生的最佳作用濃度和時間;并在最佳作用條件下研究藥物對EphB4/ephrinB2反向信號的調(diào)控。從細胞效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄水平、

5、蛋白活性水平探討血府逐瘀湯在微血管內(nèi)皮細胞中對靶信號的作用機制，從而為血府逐瘀湯適度調(diào)節(jié)血管新生和臨床應(yīng)用提供實驗支持。
　　 方法：
　　 1、含藥血清的制備。
　　 將健康成年男性志愿者隨機分為藥物干預(yù)組和空白血清組。藥物組每日按要求服用二倍劑量的血府逐瘀湯，七天為一個周期，最后一次服藥2小時后每人左靜脈采集血液50ml，高速離心制備成含藥血清，56℃水浴30分鐘滅活補體;隨后在無菌操作下用微孔濾膜進行過濾，

6、分裝后置于-20℃冰箱備用?？瞻籽褰M不做任何干預(yù)，血清制備收集方法同藥物血清。
　　 2、實驗分組。
　　 將常規(guī)培養(yǎng)的人微血管內(nèi)皮細胞（HMEC-1）隨機分為6組:血清含量分別為1.25％、2.5％、5％的空白血清干預(yù)組和藥物血清干預(yù)組，每組血清均按比例溶于含5％胎牛血清(FBS)的MCDB-131培養(yǎng)基中。
　　 3、采用基質(zhì)膠檢測藥物對HMEC-1體外成血管能力的影響。
　　 不同血清含量的藥物組

7、和空白組分別干預(yù)24h、48h和72h，應(yīng)用In VitroAngiogenesis Assay試劑盒，37℃溫箱培養(yǎng)4小時后倒置顯微鏡高倍視野下隨機計數(shù)管腔形成數(shù)量，比較相同血清含量下藥物組和空白組間的差異，并挑選出最佳藥物濃度和作用時間。
　　 4、實時定量PCR技術(shù)檢測EphB4/ephrinB2表達。
　　 用Trizol法提取總RNA，取純度合格的RNA適量，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Genbank發(fā)布的基因序列，

8、應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計靶基因和β-actin的引物。然后采用SYBR Green試劑盒檢測不同時間點基因表達情況，用2-△△CT相對定量法進行評價。
　　 5、免疫印跡法檢測EphB4/ephrinB2的表達和磷酸化表達。
　　 提取全細胞蛋白，用BCA法檢測蛋白含量確定上樣量。電泳對提取樣品進行SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白印跡到0.45um孔徑的PVDF膜上。非磷酸化抗體用5％脫脂奶粉封閉，磷酸化抗體用5％牛

9、血清白蛋白(BSA)封閉，之后放入稀釋后的一抗中4℃孵育過夜，次日室溫孵育二抗，并用化學(xué)發(fā)光試劑檢測條帶，比較表達差異。
　　 6、EphB4/ephrinB2反向信號在血府逐瘀含藥血清促血管適度生長中的作用。
　　 在空白血清組加入EphB4/fc作為反向信號激活劑組，在含藥血清中加入PP2作為反向信號抑制劑組。各組選擇不同的作用時間點和作用濃度，并應(yīng)用體外成血管技術(shù)分別比較激活劑組、抑制劑組與含藥血清組成血管能力的差

10、異，對反向信號在血府逐瘀湯促血管適度生長的作用進行細胞效應(yīng)評價。
　　 結(jié)果：
　　 1、血清含量的差異影響細胞活性，以48小時體外成血管為例，1.25％和2.5％空白血清的血管生成能力明顯弱于5％空白血清(P＜0.05)，說明血清含量不同會對結(jié)果有影響;所以，本實驗將同等血清含量的藥物組及空白組進行對比，使得結(jié)果更為客觀。
　　 2、體外成血管實驗:2.5％含藥血清干預(yù)48h促血管新生效果肯定(P＜0.05)，

11、5％含藥血清干預(yù)48h、72h后抑制血管新生的效果顯著(P＜0.01)。選定2.5％藥物血清干預(yù)48h為促血管新生最佳條件。
　　 3、實時定量PCR:2.5％藥物血清干預(yù)12小時之內(nèi)的多個時間段，EphB4-mRNA和ephrinB2-mRNA表達均未見明顯上調(diào)或下調(diào)。在隨后的時間點，EphB4-mRNA于12h上調(diào)(P＜0.05)，24h下調(diào)(P＜0.01)，48h無明顯變化;EphrinB2-mRNA的表達則是在12h、2

12、4h和48h多個時間點均無明顯波動。
　　 4、Western Blot結(jié)果:2.5％藥物血清干預(yù)24h，EphrinB2表達有顯著提高(P＜0.01)，反向信號ephrinB2磷酸化活化水平在9小時有較明顯升高(P＜0.05)。
　　 5、在藥物最佳作用條件下，分別激活和阻斷EphB4/ephrinB2反向信號的傳遞，通過比較含藥血清組與最佳濃度激活劑組體外成血管數(shù)目，證實藥物干預(yù)組與反向信號激活劑組在促血管新生方面作

13、用相當(dāng)(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、血府逐瘀湯能雙向調(diào)控血管生長，不同藥物濃度或是同一藥物濃度不同作用時間對血管生成的影響不同，不僅能促血管新生，而且還能發(fā)揮抑制作用。
　　 2、血府逐瘀湯干預(yù)9h，反向通路受體活性狀態(tài)EphrinB2磷酸化水平顯著升高，結(jié)合反向信號刺激劑和抑制劑的實驗結(jié)果，充分說明藥物促血管新生作用與激活EphB4/ephrinB2反向信號通路有關(guān)。
　　 3、血府逐瘀湯