鈣離子對高基質(zhì)金屬蛋白酶-9狀態(tài)下心肌成纖維細胞的影響.pdf

1、研究背景:
　　心室重構(ventricular remodeling)是多種心血管疾病心臟功能由代償向失代償轉變的重要病理生理基礎。探討心室重構的發(fā)生發(fā)展機制,從而阻逆心室重構的發(fā)生,對改善心血管病患者預后具有重要的意義。
　　心室重構包括心肌細胞和細胞外基質(zhì)(extracellar matrix,ECM)重構,前者為心肌細胞本身結構、代謝及功能異常改變,后者主要是指心肌成纖維細胞(Cardiac fibroblasts,

2、CFs)增殖和膠原網(wǎng)絡的含量及組成發(fā)生改變?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組內(nèi)源性蛋白酶的家族,存在于多種組織中,并具有降解細胞外基質(zhì)等功能。近年研究發(fā)現(xiàn),心肌組織中也存在多種MMP,其中MMP-9是心肌組織中含量較高的MMP。既往研究顯示,一些心血管疾病演變過程中存在MMP-9表達增高,同時伴有心肌ECM成分發(fā)生變化、心肌纖維化、室壁順應性降低、心功能異常等心室重構表現(xiàn)。例如:心肌梗

3、死后心肌組織中MMP-9表達升高,左心室擴大,敲除MMP-9基因后心室擴大改善。Chua等研究發(fā)現(xiàn)擴張型心肌病大鼠心肌組織中MMP-9表達升高,心肌纖維化明顯,心肌收縮力下降。可見MMP-9表達增高與某些心血管疾病心室重構可能有密切關系。另一方面,有研究顯示,鈣離子對多種組織MMP-9的表達和組織重構存在影響,例如:Jiang等發(fā)現(xiàn)增加肝癌細胞鈣離子內(nèi)流能促進其MMP-9的釋放與激活;Hwang等發(fā)現(xiàn)通過使用鈣離子螯合劑減少腫瘤細胞內(nèi)鈣

4、離子能抑制MMP-9的分泌;Shen X.C.等對去甲腎上腺素誘導的小鼠心肌肥厚模型研究發(fā)現(xiàn),用藏紅花素使心肌細胞內(nèi)鈣離子減少,能降低心肌細胞MMP-9表達并改善心室重構;楊永健等在心肌梗死大鼠模型中使用鈣離子通道阻滯劑阿莫地平和米貝拉地爾,結果發(fā)現(xiàn)兩種鈣離子通道阻滯劑均能抑制心肌組織MMP-9的表達,減少細胞外基質(zhì)纖維連接蛋白的降解,改善心室重構等等。心肌成纖維細胞作為心肌間質(zhì)中的主要細胞(占心肌間質(zhì)細胞90％以上),能合成和分泌多種

5、活性物質(zhì),調(diào)節(jié)膠原含量,在心肌細胞外基質(zhì)重構中占重要地位。然而,鈣離子能否對心肌成纖維細胞的MMP-9表達、成纖維細胞增殖和膠原代謝產(chǎn)生同樣的影響卻少見報道。鈣離子作為機體的一種電解質(zhì)存在于多種組織,包括心肌組織。在一些心血管疾病,如,心肌梗死、高血壓、心肌病等,往往存在心肌組織高MMP-9狀態(tài)和高鈣狀態(tài)(例如,缺血再灌注、炎癥等可造成局部鈣超負荷)。因此研究在高MMP-9狀態(tài)下,鈣離子對心肌成纖維細胞的MMP-9表達、成纖維細胞增殖和

6、膠原代謝、對MMP-9活性的影響,將有助于進一步闡明某些心血管疾病狀態(tài)下心室重構機制及尋求新的治療靶點。
　　目的:
　　探討不同細胞鈣離子濃度對高MMP-9狀態(tài)下心肌成纖維細胞的影響及其作用機制,為進一步闡明心室重構的發(fā)病機制提供依據(jù),同時為心室重構尋求新的治療途徑。
　　材料與方法:
　　1.MMP-9、氯化鈣(CaCL2)以及MMP-9+CaCL2對心肌成纖維細胞(CFs)增殖影響的研究
　　將2-3

7、代的wistar大鼠乳鼠心肌成纖維細胞(CFs)以1×106/孔的細胞密度接種于96孔板,按以下方式分組,每組設置3個復孔,加入相應培養(yǎng)液孵育24小時后,使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測細胞增殖情況。具體分組如下:
　　1.1、MMP-9對CFs增殖影響的研究
　　分為:
　?、賹φ战M(加入單純培養(yǎng)液10μl);
　?、?0nM MMP-9組(加入MMP-9終濃度為40nmol/L的

8、培養(yǎng)液10μl);
　　③200nM MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　?、?μM MMP-9組(加入MMP-9終濃度為1μmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　?、?μM MMP-9組(加入MMP-9終濃度為5μmol/L的培養(yǎng)液10μl)。
　　1.2、CaCL2對CFs增殖影響的研究
　　分為:
　?、賹φ战M(加入單純培養(yǎng)液10μl);
　　②0.2

9、mM CaCL2組(加入CaCL2終濃度為0.2mmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　　③0.4mM CaCL2組(加入CaCL2終濃度為0.4mmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　?、?.8mM CaCL2組(加入CaCL2終濃度為0.8mmol/L的培養(yǎng)液10μl)。
　　1.3、MMP-9+CaCL2對CFs增殖影響的研究
　　分為:
　?、賹φ战M(加入單純培養(yǎng)液10μl);
　?、谀Ｐ徒M(加入MM

10、P-9終濃度為200nmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　?、?.2mM CaCL2+MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.2mmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　　④0.4mM CaCL2+MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.4mmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　?、?.8mM CaCL2+MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol

11、/L、CaCL2終濃度為0.8mmol/L的培養(yǎng)液10μl)。
　　2.不同Ca2+濃度對高MMP-9狀態(tài)下心肌成纖維細胞MMP-9和膠原表達影響的研究
　　從以上實驗基礎上選擇200nmol/L的MMP-9為高MMP-9狀態(tài),建立高MMP-9狀態(tài)模型。將心肌成纖維細胞(CFs)接種于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶,使細胞密度為1×106個/瓶。貼壁后換無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后分為:
　?、賹φ战M(加入單純

12、培養(yǎng)液5ml);
　?、阝}離子螯合劑(BAPTA-AM)組(加入BAPTA-AM終濃度為10μmol/L、MMP-9終濃度為200nmol/L的培養(yǎng)液5ml);
　?、勰Ｐ徒M:(加入MMP-9終濃度為200nmol/L的培養(yǎng)液5ml);
　?、?.2mM CaCL2+MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.2mmol/L的培養(yǎng)液5ml);
　?、?.4mM CaCL2+MMP

13、-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.4mmol/L的培養(yǎng)液5ml);
　　⑥0.8mM CaCL2+MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.8mmol/L的培養(yǎng)液5ml);
　　⑦維拉帕米組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.8mmol/L、維拉帕米終濃度為50μmol/L的培養(yǎng)液5ml)。
　　孵育24小時后,提取

14、細胞蛋白和RNA,用免疫印跡法(western blotting)檢測孵育物中MMP-9以及Ⅰ型(collagen I)、Ⅲ型膠原(collagen III)水平;QRT-PCR法檢測細胞中MMP-9mRNA和collagen I及collagen III mRNA的表達和用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度變化。
　　3.不同Ca2+濃度對MMP-9活性影響的研究
　　將MMP-9分成3組,每組MMP-9的量為1μg,加入不同

15、濃度的CaCL2相互作用30min后用明膠酶譜法檢測MMP-9的活性。分組情況如下:
　?、賹φ战M(加入單純培養(yǎng)液0.5ml);
　　②0.4mM CaCL2組(加入CaCL2終濃度為0.4mmol/L的培養(yǎng)液0.5ml);
　?、?.8mM CaCL2組(加入CaCL2終濃度為0.8mmol/L的培養(yǎng)液0.5ml)。
　　結果:
　　1.MMP-9對心肌成纖維細胞增殖的影響
　　隨著MMP-9濃度的

16、升高,從對照組、40nM MMP-9組、200nM MMP-9至1μM MMP-9組心肌成纖維細胞增殖依次升高,組間比較(p<0.05),但MMP-9濃度達到5μM時心肌成纖維細胞增殖較1μM MMP-9組低(p<0.05),與200nM MMP-9組相仿(p>0.05)。
　　2.不同Ca2+濃度對心肌成纖維細胞增殖的影響
　　不同CaCL2濃度組之間心肌成纖維細胞增殖情況無明顯差異(p>0.05)。
　　3.不同C

17、a2+濃度對高MMP-9狀態(tài)下心肌成纖維細胞增殖的影響
　　在高MMP-9狀態(tài)下,加入不同濃度Ca2+后,隨著Ca2+濃度的升高,CFs增殖有逐漸升高的趨勢,但僅當Ca2+濃度為0.8mM時CFs增殖才明顯高于對照組(p<0.05)。
　　4.不同Ca2+濃度對心肌成纖維細胞MMP-9、collagen I、collagen III表達的影響。
　　4.1、不同Ca2+濃度對心肌成纖維細胞MMP-9表達的影響
　

18、　在高MMP-9狀態(tài)下,隨著ca2+濃度升高,對照組、BAPTA-AM組、模型組、0.2mM CaCL2+MMP-9組至0.8mM CaCL2+MMP-9組的MMP-9mRNA表達依次增高,組間比較差異顯著(p<0.05),使用維拉帕米干預后,MMP-9mRNA表達明顯降低(與0.8mMCaCL2+MMP-9組比較p<0.01),與對照組相仿(p>0.05)。MMP-9蛋白表達從模型組、0.2mM CaCL2+MMP-9組、0.4mM

19、CaCL2+MMP-9組至0.8mM CaCL2+MMP-9組依次增高,組間比較差異顯著(p<0.05)。使用BAPTA-AM干預后,MMP-9的表達降低(與模型組比較p<0.05),與對照組相近似(p>0.05)。使用維拉帕米干預后,MMP-9的表達降低(與0.8mM CaCL2+MMP-9組比較p<0.05),與對照組比較無明顯差異(p>0.05)。
　　4.2、不同Ca2+濃度對collagenI表達的影響
　　在高M

20、MP-9狀態(tài)下,隨著Ca2+濃度升高,collagen I mRNA表達從對照組、模型組、0.2mM CaCL2+MMP-9組、0.8mM CaCL2+MMP-9組表達依次增高,組間比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05),使用BAPTA-AM干預后,collagen I mRNA的表達降低(與模型組比較p<0.001)。使用維拉帕米干預后,collagen I mRNA的表達降低(與0.8mM CaCL2+MMP-9組比較p<0.001),并

21、低于對照組(p<0.001)。collagen I蛋白表達從對照組、BAPTA-AM組、模型組、0.2mM CaCL2+MMP-9組、0.4mM CaCL2+MMP-9組、0.8mM CaCL2+MMP-9組逐漸降低,組間比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05),使用維拉帕米干預后,collagen I蛋白表達較0.8mM CaCL2+MMP-9組升高(p<0.01),但仍低于對照組(p<0.05)。
　　4.3、不同Ca2+濃度對col

22、lagen III表達的影響
　　在高MMP-9狀態(tài)下,隨著Ca2+濃度升高,collagen III mRNA表達從對照組、模型組、0.2mM CaCL2+MMP-9組、0.8mM CaCL2+MMP-9組表達依次增高,組間比較有顯著差異(p<0.05),使用BAPTA-AM干預后,collagen III mRNA的表達降低(與模型組比較p<0.001)。使用維拉帕米干預后,collagen III mRNA的表達降低(與0.

23、8mM CaCL2+MMP-9組比較p<0.001),并低于對照組(p<0.001)。而各組collagen III蛋白表達均低于對照組(p<0.05),組間比較無明顯差異(p>0.05)。使用維拉帕米干預后collagen III蛋白表達升高(與0.8mMCaCL2+MMP-9組比較p<0.05),但仍低于對照組(p<0.05)。
　　以上各組細胞內(nèi)鈣離子濃度(以下用[Ca2+]i表示)的變化由模型組到0.8mM CaCL2+M

24、MP-9組依次升高,組間比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05);模型組與對照組相仿(p>0.05)。使用BAPTA-AM干預后,[Ca2+]i降低(與模型組比較p<0.05)。使用維拉帕米干預后,[Ca2+]i降低(與0.8mM CaCL2+MMP-9組比較p<0.001),并與對照組相仿(p>0.05)。
　　5.[Ca2+]i與MMP-9表達水平的相關性分析
　　[Ca2+]i與MMP-9蛋白水平呈正相關(r=0.884p<0

25、.001),與MMP-9mRNA水平呈正相關(r=0.950P<0.001))。
　　6.[Ca2+]i和MMP-9與Ⅰ、Ⅲ型膠原的相關性分析
　　[Ca2+]i與Ⅰ型膠原mRNA表達呈正相關(r=0.698p<0.001)與Ⅰ型膠原蛋白表達呈負相關(r=-0.913p<0.001);MMP-9與Ⅰ型膠原mRNA表達呈正相關(r=0.841p<0.001)與Ⅰ型膠原蛋白表達呈負相關(r=-0.942p<0.001);偏相關分

26、析顯示,在控制MMP-9因素后,[Ca2+]i與Ⅰ型膠原mRNA表達呈負相關(r=-0.599p<0.01)與Ⅰ型膠原蛋白表達呈負相關(r=-0.512p<0.05)。在控制[Ca2+]i因素后,MMP-9與Ⅰ型膠原mRNA表達呈正相關(r=0.796p<0.001);MMP-9與Ⅰ型膠原蛋白表達呈負相關(r=-0.707p<0.001)。
　　[Ca2+]i與Ⅲ型膠原mRNA表達呈正相關(r=0.733p<0.001)與Ⅲ型膠原

27、蛋白表達呈負相關(r=-0.721p<0.001);MMP-9與Ⅲ型膠原mRNA表達呈正相關(r=0.868p<0.001)與Ⅲ型膠原蛋白表達呈負相關(r=-0.707p<0.001);偏相關分析顯示,在控制MMP-9因素后,[Ca2+]i與Ⅲ型膠原mRNA表達呈負相關(r=-0.599p<0.01)與Ⅲ型膠原蛋白表達無顯著相關(r=-0.290p>0.05)。在控制[Ca2+]i因素后,MMP-9與Ⅲ型膠原mRNA表達呈正相關(r=0

28、.812p<0.001)與Ⅲ型膠原蛋白表達無顯著相關(r=-0.215p>0.05)。
　　[Ca2+]i與Ⅰ/Ⅲ型膠原比值呈負相關(r=-0.915p<0.001),MMP-9與Ⅰ/Ⅲ型膠原比值呈負相關(r=-0.942p<0.001)。偏相關分析顯示,在控制MMP-9因素后,[Ca2+]i與Ⅰ/Ⅲ型膠原比值呈負相關(r=-0.522p<0.05)。在控制[Ca2+]i因素后,MMP-9與Ⅰ/Ⅲ型膠原比值呈負相關(r=-0.72

29、2p<0.001)。
　　7.不同Ca2+濃度對MMP-9活性的影響
　　MMP-9的活性隨Ca2+濃度升高而降低,組間比較有統(tǒng)計學差異(p<0.001)。
　　結論:
　　1.鈣離子能使高MMP-9狀態(tài)下心肌成纖維細胞增殖。
　　2.鈣離子能抑制MMP-9的活性。
　　3.鈣離子能促進心肌成纖維細胞MMP-9的合成與表達,從而降解Ⅰ、Ⅲ型膠原,使Ⅰ/Ⅲ膠原比例降低。
　　4.鈣通道阻滯劑和鈣離