化學(xué)限定性培養(yǎng)基添加卵泡抑素對(duì)豬胚胎體外發(fā)育的影響.pdf

1、體外培養(yǎng)（In vitro culture，IVC）是胚胎體外生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，對(duì)動(dòng)物良種繁育、生殖與發(fā)育機(jī)理研究具有重要意義。當(dāng)前，豬的胚胎在IVC后發(fā)育效率和質(zhì)量均不理想，主要與豬IVC培養(yǎng)基不理想有關(guān)。研究表明，卵泡抑素（Follistatin，F(xiàn)ST）能夠加速牛和恒河猴早期胚胎首次卵裂，并提高囊胚發(fā)育效率及質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)，在完全培養(yǎng)基中添加FST雖然對(duì)豬胚胎早期體外發(fā)育有影響，但與牛、猴上的報(bào)道不盡一致。因此，本研究擬

2、通過在化學(xué)限定性的IVC培養(yǎng)基（PZM-4）中補(bǔ)充 FST，旨在探討FST對(duì)豬胚胎體外發(fā)育的真實(shí)影響，為進(jìn)一步優(yōu)化豬早期胚胎IVC體系提供依據(jù)。具體試驗(yàn)如下：
　　試驗(yàn)一不同亞型FST對(duì)豬孤雌激活胚胎（Parthenogenetic Activation Embryos，PAEs）早期發(fā)育的影響。將10 ng/mL不同亞型FST（FST-315、FST-300、FST-288）分別獨(dú)立添加至PZM4中作為處理組，以不添加FST的P

3、ZM-4為對(duì)照組；激活后立即將PAEs隨機(jī)等量分配到各組、同等條件下進(jìn)行IVC。結(jié)果表明，各亞型FST均可顯著提高胚胎早期卵裂率（IVC第24h卵裂率；P<0.05），各組IVC第48h總卵裂率無明顯差異。FST-300組囊胚率顯著提高（P<0.05），而 FST-288主要促進(jìn)囊胚總細(xì)胞數(shù)增加（P<0.05）。
　　試驗(yàn)二不同亞型FST（FST-315、FST-300、FST-288）對(duì)豬核移植胚胎（Somatic CellNu

4、clear Transfer Embryos，NTEs）早期發(fā)育的影響。分組與試驗(yàn)一相同；將重構(gòu)胚隨機(jī)等量分配到各組、同等條件下進(jìn)行IVC。結(jié)果顯示，F(xiàn)ST-315和FST-300有提高NTEs早卵裂率和總卵裂率的趨勢，但與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）；在囊胚率和囊胚質(zhì)量上，各亞型FST對(duì)NTEs囊胚率、囊胚總細(xì)胞數(shù)和滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)的提高也不顯著（P＞0.05），但相對(duì)而言，在處理組中FST-300促進(jìn)趨勢較好。
　　試驗(yàn)三

5、不同濃度FST-300對(duì)豬NTEs體外發(fā)育的影響。以未添加FST-300的PZM-4為對(duì)照組，以分別添加10ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL FST-300的PZM-4為處理組，隨機(jī)將NTEs等量分配到各實(shí)驗(yàn)組，再于同等條件下進(jìn)行IVC。結(jié)果是，20ng/mL處理組顯著提高了NTEs總卵裂率（P<0.05）；各組間NTEs囊胚率、囊胚總細(xì)胞數(shù)和TE細(xì)胞數(shù)差異不明顯（P＞0.05）。
　　試驗(yàn)四為進(jìn)一步篩選不同亞型FST

6、最適添加濃度，以不加FST蛋白為對(duì)照組，分別在PZM-4中設(shè)定三種亞型FST蛋白的濃度梯度：FST-315（1、5、10 ng/mL），F(xiàn)ST-300（10、20、50 ng/mL），F(xiàn)ST-288（10、20、50 ng/mL），探討能促進(jìn)豬PAEs體外發(fā)育的FST最優(yōu)亞型及濃度。結(jié)果顯示，分別添加三種亞型FST的對(duì)應(yīng)所有濃度梯度均可顯著提高PAEs早期卵裂率（P<0.05），其中以20ng/mL FST-300處理組作用最明顯。此外

7、，10ng/mL和20ng/mL的FST-300還可顯著改善PAEs囊胚發(fā)育率（P<0.05）；5ng/mL FST-315組、20ng/mL FST-300組、10ng/mL和50ng/mL FST-288組對(duì)豬PAEs體外發(fā)育的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在囊胚總細(xì)胞數(shù)上（P<0.05）。
　　試驗(yàn)五不同亞型FST、不同濃度組合對(duì)豬PAEs體外發(fā)育的影響。以未添加FST的PZM-4為對(duì)照組，試驗(yàn)組則是在PZM-4中聯(lián)合添加不同亞型的FST

8、，其中組合1是聯(lián)合添加FST-300（20ng/mL）、FST-315（5ng/mL）和FST-288（10ng/mL）；組合2是聯(lián)合添加FST-300（20ng/mL）、FST-315（5ng/mL）；組合3是聯(lián)合添加FST-300（20ng/mL）、FST-288（10ng/mL）；組合4是聯(lián)合添加FST-315（5ng/mL）、FST-288（10ng/mL）。組合5為單一添加FST-300（20ng/mL）。結(jié)果表明，與空白對(duì)照

9、組相比，上述單一添加和組合添加均可顯著提高PAEs的早期卵裂率（P<0.05）；在囊胚率上，組合1、2、3和5均有明顯促進(jìn)作用（P<0.05）；從囊胚總細(xì)胞數(shù)來看，組合4和5可顯著改善囊胚質(zhì)量（P<0.05）。但對(duì)照組、組合1和5之間的GDF9、BAX、BCL-xl、p53、KLF4、SOX2、OCT4、CDX2等胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。
　　總之，本研究不僅發(fā)現(xiàn)FST對(duì)豬PAEs和NTEs的體外發(fā)育具有不