大鼠吸入過氧化甲乙酮后脂質(zhì)過氧化損傷作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、MEKP(Methyl Ethyl Ketone Peroxide，MEKP)即過氧化甲乙酮，主要作為玻璃纖維塑料的硬化劑和不飽和聚酯樹脂的固化劑廣泛應(yīng)用于聚酯及丙烯酸樹脂的生產(chǎn)。目前國內(nèi)MEKP的生產(chǎn)量和使用量逐年在增加，職業(yè)接觸和非職業(yè)接觸人數(shù)不斷增多，MEKP的毒性作用也越來越受到人們的關(guān)注。MEKP具有多方面的毒性效應(yīng)，主要是對黏膜和皮膚的強(qiáng)烈刺激作用與對各臟器的脂質(zhì)過氧化損害。MEKP的毒性機(jī)制可能是通過生成自由基導(dǎo)致脂質(zhì)過氧

2、化反應(yīng)使細(xì)胞膜受損，從而使細(xì)胞功能障礙而致凋亡或壞死。國內(nèi)外對于MEKP中毒的病例報告一般是誤食或自殺導(dǎo)致中毒，會導(dǎo)致消化道灼傷，結(jié)構(gòu)和功能均受損。但在工作環(huán)境中，人群通常是經(jīng)呼吸道和皮膚兩種途徑接觸。本研究擬通過大鼠亞慢性吸入MEKP模型，通過MEKP對大鼠機(jī)體的慢性損害模式，探討MEKP的毒性機(jī)制，為職業(yè)暴露人群的防護(hù)和易感人群的篩選提供基礎(chǔ)依據(jù)。
　　 目的：
　　 本研究擬通過亞慢性吸入MEKP動物模型，通過ME

3、KP對大鼠機(jī)體的慢性損害模式，觀察過氧化甲乙酮亞慢性吸入后對大鼠主要器官的病理學(xué)改變，以及對肝臟氧化應(yīng)激水平的影響，闡述MEKP的脂質(zhì)過氧化損害作用，探討大鼠吸入過氧化甲乙酮(MEKP)氣溶膠后的氧化損傷機(jī)制及其職業(yè)人群的醫(yī)學(xué)防護(hù)提供線索。
　　 方法：
　　 建立大鼠MEKP亞慢性染毒模型，SD大鼠100只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只。染毒組暴露于50mg/m3、500mg/m3和1000mg/m3的MEKP氣

4、溶膠，空白對照組暴露于清潔空氣，溶劑對照組暴露于溶劑氣溶膠，6h/d，5d/w，共13周。
　　 1.染毒期間動物一般情況和病理結(jié)果觀察:
　　 染毒期間，觀察大鼠食欲和活動等一般狀況。染毒結(jié)束后，稱重，CO2麻醉處死解剖大鼠，取肝臟、肺、脾、腎、氣管、卵巢或睪丸，稱重，用體積分?jǐn)?shù)為10％的中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成5μm厚切片，HE常規(guī)染色，切片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理觀察。
　　 2.大鼠肝臟G

5、SH、MDA含量和SOD活力的測定:用TBA法和考馬斯亮藍(lán)染色法分別測定上清液中MDA、GSH及蛋白質(zhì)含量，GSH、MDA含量結(jié)果以“mg/g·pro”表示，用黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶-亞硝酸鹽法測定SOD活力，SOD活力結(jié)果以“U/mgpro”表示。
　　 3.大鼠肝臟CYP450、NADH活性的測定:切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，pH7.4，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），取一

6、份上清按試劑盒說明操作進(jìn)行ELISA分析測定樣本活性。
　　 4.大鼠血液中AST、ALT、PLT水平的測定:大鼠CO2麻醉，眼球靜脈取血5mL，加入抗凝劑EDTA，按照AST、ALT、PLT測定試劑盒測定血中AST、ALT、PLT水平。
　　 5.結(jié)果處理:采用SPASS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中的ANOVA方法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和多重比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理組織切片用MotieMC20001

7、.0版顯微照相系統(tǒng)和Adobe photoshop7.0處理。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠臟器系數(shù)變化及主要臟器病理損害情況大鼠吸入MEKP氣溶膠13周后，1000mg/m3MEKP染毒組雄性大鼠腎臟、胸腺、睪丸臟器系數(shù)顯著低于空白對照組、溶劑對照組及其余各劑量組(P＜0.05);1000mg/m3MEKP染毒組雄性大鼠體重顯著低于空白對照組、溶劑對照組。1000mg/m3MEKP染毒組、500mg/m3MEKP染毒組

8、部分大鼠支氣管、肺、肝、脾、腎、睪丸出現(xiàn)明顯損傷，呈現(xiàn)病變發(fā)生率增高及病變程度加重的趨勢。支氣管出現(xiàn)纖毛柱狀上皮脫落，粘膜及粘膜下淋巴細(xì)胞浸潤;肺臟損傷主要表現(xiàn)為肺泡過度充氣，肺泡壁毛細(xì)血管充血;肝損傷表現(xiàn)為肝細(xì)胞及匯管區(qū)小膽管上皮細(xì)胞水腫，嗜酸性變及脂肪變性;脾臟腫大，局灶型中性粒細(xì)胞浸潤，白髓比例明顯降低。1000mg/m3MEKP染毒組與500mg/m3MEKP染毒組部分雄性大鼠睪丸多級生精細(xì)胞發(fā)育不良，精子數(shù)目明顯減少，甚至變性

9、、壞死。
　　 2.大鼠肝臟GSH、MDA含量、SOD活力變化情況在1000mg/m3MEKP染毒組雄性大鼠中，肝臟內(nèi)GSH含量顯著低于其余各組雄性大鼠肝臟內(nèi)GSH含量，SOD活性顯著低于其余各組雄性大鼠肝臟內(nèi)SOD活力，MDA含量顯著高于空白對照組肝臟內(nèi)MDA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在1000mg/m3MEKP染毒組雌性大鼠中，肝臟內(nèi)GSH含量顯著低于其余各組雄性大鼠肝臟內(nèi)GSH含量，SOD活性顯著高于空白對照

10、組、溶劑對照組雌性大鼠肝臟內(nèi)SOD活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05）。在500mg/m3MEKP染毒組，雄性大鼠肝臟內(nèi)GSH含量顯著低于其余各組雄性大鼠肝臟內(nèi)GSH含量，SOD活力顯著低于空白對照組、溶劑對照組雄性大鼠肝臟內(nèi)SOD活性，MDA含量顯著高于空白對照組雄性大鼠肝臟內(nèi)MDA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);雌性大鼠肝臟內(nèi)SOD活力顯著高于空白對照組、溶劑對照組雌性大鼠肝臟內(nèi)SOD活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05）。實(shí)

11、驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠吸入一定劑量的MEKP氣溶膠后，可對肝臟造成一定程度的氧化損傷，MDA含量顯著升高，機(jī)體抗氧化能力受損，GSH含量、SOD活性顯著下降。
　　 3.大鼠肝臟NADH與CYP450活性的變化情況在1000mg/m3MEKP染毒組雄性大鼠，肝臟NADH、CYP450的活性顯著高于空白對照組、溶劑對照組、50mg/m3MEKP染毒組;雌性大鼠肝臟NADH、CYP450的活性顯著高于空白對照組、溶劑對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義(P＜0.05);在500mg/m3MEKP染毒組中，雌、雄性大鼠中，肝臟NADH、CYP450的活性顯著高于空白對照組、溶劑對照組、50mg/m3MEKP染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;試驗(yàn)結(jié)果表明大鼠吸入MEKP后，MEKP可結(jié)合并破壞大鼠肝臟內(nèi)的NADH與CYP450，使其活性降低，繼而導(dǎo)致活性下降。
　　 4.大鼠血液中AST、ALT、PLT水平變化情況在1000mg/m3MEKP染毒組中，雄性大鼠血液中AS

13、T測定結(jié)果顯著高于空白對照組、溶劑對照組、50mg/m3MEKP染毒組，雌性大鼠血液中AST測定結(jié)果顯著高于空白對照組、溶劑對照組、50mg/m3MEKP染毒組、500mg/m3MEKP染毒組，雄性大鼠血液中ALT測定結(jié)果顯著高于空白對照組、溶劑對照組、50mg/m3MEKP染毒組，雌性大鼠肝臟ALT測定結(jié)果顯著高于空白對照組、溶劑對照組、50mg/m3MEKP染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。500mg/m3MEKP染毒組中，

14、雌雄大鼠血液中AST測定結(jié)果顯著高于空白對照組、溶劑對照組、50mg/m3MEKP染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);大鼠吸入MEKP氣溶膠13周后，肝臟匯管區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)脂肪滴，發(fā)生脂肪變性，纖維化病變，導(dǎo)致肝功能異常。1000mg/m3MEKP染毒組雄性大鼠血小板水平與空白對照組、溶劑對照組、50mg/m3MEKP染毒組之間相比，出現(xiàn)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.500mg/

15、m3濃度的MEKP氣溶膠可對大鼠臟器產(chǎn)生明顯的病理損傷作用，雄性大鼠的損傷情況相比雌性大鼠較為嚴(yán)重。提示MEKP對大鼠的損傷作用有性別差異，對雄性大鼠造成的損傷作用較嚴(yán)重。
　　 2.500mg/m3濃度的MEKP氣溶膠可以使大鼠肝臟氧化應(yīng)激水平顯著下降，MDA含量升高，GSH含量、SOD活性顯著下降，說明MEKP在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了過多的自由基。
　　 3.500mg/m3濃度的MEKP氣溶膠會導(dǎo)致大鼠肝臟功能嚴(yán)重受損，AS