膀胱過度活動癥大鼠逼尿肌中嘌呤能受體P2X-,1-的表達.pdf

1、膀胱過度活動癥(Overactive bladder，OAB)是一種以癥狀學診斷為基礎的新的概念。國際尿控學會2002年將OAB的概念正式定義為一種提示下尿路功能障礙的癥狀綜合征，主要表現(xiàn)為尿急，伴或不伴急迫性尿失禁，通常伴有尿頻和夜尿，嚴重的可因尿不凈導致雙腎、輸尿管積水而形成腎功能損害，從而危及生命。OAB多由逼尿肌的無抑制性收縮所致，其發(fā)病率很高，對患者的生理和心理發(fā)育均有嚴重的影響，使生活質(zhì)量下降。 OAB的病因復雜，

2、目前尚不完全清楚，主要與膀胱尿道神經(jīng)源性、解剖和功能異常有關。目前雖然對OAB的治療方法很多，但只能緩解癥狀，不能達到治愈。因此正確的治療和處理OAB非常必要。 P2X受體是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種嘌呤能ATP受體，它廣泛分布于全身各種組織，主要參與平滑肌的舒張與收縮調(diào)節(jié)，在人類的膀胱感覺和逼尿肌收縮方面起重要作用，但其在OAB的發(fā)生、發(fā)展過程中具體機制尚不完全清楚。由于很難得到人類OAB的組織標本，故本研究在成功制做OAB大鼠模型

3、的基礎上，經(jīng)尿動力學檢查確定診斷，獲取OAB大鼠膀胱組織；應用RT-PCR、免疫組化等方法檢測P2X1受體在正常大鼠以及OAB大鼠膀胱逼尿肌中的表達，初步探討P2X1受體在OAB時膀胱舒縮功能調(diào)節(jié)中的作用及其與膀胱功能障礙的關系，為臨床治療OAB所引起的膀胱功能障礙提供新的理論依據(jù)。 實驗材料 一、實驗動物 雌性Wistar大白鼠32只，3-4個月，250克左右，購自中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物中心。 二

4、、實驗試劑 總RNA分離試劑(tiands，中國天澤基因工程有限公司)；RT-PCR試劑盒，DNA聚合酶(TAKaRa，大連寶生物工程有限公司)；P2X1受體亞型基因mRNA引物為美國Medline國立圖書館基因庫檢索基因，計算機Primer5.0版軟件自行設計(英俊生物技術(shù)有限公司)；一抗P2X1受體抗體(chemicon公司，美國)，免疫組化UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

5、 三、主要實驗儀器設備 眼科手術(shù)器械；紫外分光光度計(UV-1201型，SHIMAD2u，Japan)；PCR擴增儀(Biotron，Germany)；臺式低溫高速離心機(5417R，EppendorfAG，Germany)水平電泳槽及電泳儀均產(chǎn)自中國；自動電泳凝膠成像分析儀(Kodak，1D，USA)；Leica RM2025型石蠟切片機(德國)；Nikon型光學顯微鏡(Nikon Eclipse E800micros

6、cope，Kawasaki，Kanagawa，日本)；醫(yī)用微波爐(Galantz)。 實驗方法 1、所有32只大鼠經(jīng)尿動力學檢查無異常后，納入實驗研究。分為正常對照組(A組，10只)和模型組(B組，22只)。B組大鼠全部進行動物實驗，結(jié)扎大鼠膀胱-尿道交界處，造成膀胱出口部分梗阻，再經(jīng)尿動力學檢測，以充盈期逼尿肌出現(xiàn)無抑制性收縮為診斷OAB的標準，根據(jù)OAB的有無將B組再分為B2組(膀胱過度活動癥組)和B1組(模型對照組

7、)。 2、采用RT-PCR、免疫組織化學的方法檢測P2X1受體在正常大鼠和OAB大鼠逼尿肌中的表達情況，探討P2X1受體在OAB膀胱功能調(diào)節(jié)中的作用及其與膀胱功能障礙的關系。 3、所有數(shù)據(jù)均以-x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 一、動物模型及尿動力學檢測結(jié)果 A組10只大鼠全部存活，無OAB出現(xiàn)，膀胱壁光滑，彈性良好。B組22只大鼠，

8、因尿路感染等原因死亡3只，存活19只。經(jīng)尿動力學檢測，A組膀胱充盈期曲線平滑，無逼尿肌收縮，排尿期逼尿肌反射正常(18.1±4.7cmH2O)；最大膀胱灌注量為0.5ml；B組中52％(10/19)存在OAB(B2組)，表現(xiàn)為膀胱壁增厚，彈性較差。膀胱在充盈期有不規(guī)律的無抑制性收縮，逼尿肌收縮時于尿道外口有尿液溢出，單位時向內(nèi)非抑制性收縮的發(fā)生頻率為(2.9±1.2次/min)，排尿期未見明顯的逼尿肌反射；B組中47％(9/19)無OA

9、B(B1組)，表現(xiàn)為膀胱壁光滑，彈性良好。膀胱于充盈期未見明顯的逼尿肌收縮及溢尿現(xiàn)象。 二、RT-PCR結(jié)果 A組、B1組及B2組的膀胱逼尿肌中均有P2X1受體mRNA的表達，其相對表達量分別為(1.805±0.102)、(1.821±0.068)和(1.968±0.063)。P2X1受體mRNA在B2組大鼠膀胱逼尿肌中的表達較A、B1組高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。B1組P2X1受體mRNA較A組表達無明顯差異

10、，無統(tǒng)計學意義(P=0.737) 三、免疫組織化學結(jié)果 A組、B1組及B2組中膀胱逼尿肌細胞的胞漿中均有P2X1受體的表達，B2組與A組、B1組相比，膀胱粘膜增厚，肌纖維增粗，肌絲紊亂，其膀胱逼尿肌中免疫陽性顆粒呈現(xiàn)深染，較A組、B1組數(shù)量明顯增多。A組、B1組膀胱逼尿肌中黃褐色免疫陽性顆粒數(shù)量較少，顏色較淺，二者無明顯差異。 結(jié)論： 1、大鼠的下尿路梗阻，可引起膀胱的神經(jīng)和功能性損害繼而出現(xiàn)OAB，因