解脲脲原體基因突變導(dǎo)致對(duì)司帕沙星耐藥的研究.pdf

1、目的：l.研究解脲脲原體(Uu)編碼Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶的基因喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)突變與喹諾酮耐藥的關(guān)系。 2．研究司帕沙星對(duì)Uu有無(wú)明確的首要靶酶。 3．如果司帕沙星對(duì)Uu有明確的首要靶酶，它是DNA促旋酶還是拓?fù)洚悩?gòu)酶IV。 4．對(duì)司帕沙星耐藥的Uu是否對(duì)其他喹諾酮類藥物交叉耐藥。 方法：提取對(duì)喹諾酮類藥物敏感的Uu臨床分離株的。DNA，對(duì)其編碼DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的基因的QRDR進(jìn)行：PC

2、R擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，并測(cè)司帕沙星、環(huán)丙沙星、氟羅沙星、依諾沙星對(duì)其的最低抑菌濃度(MIC)。將37℃中24h內(nèi)顏色未改變的最末一管的藥物濃度定為MIC。24h之后，待試管內(nèi)液體培養(yǎng)基顏色不再發(fā)生改變時(shí)，取其中顏色發(fā)生改變且司帕沙星濃度最大的一管在瓊脂培養(yǎng)基上劃板并培養(yǎng)，然后挑2個(gè)菌落(即2個(gè)第一代耐藥突變株)用液體培養(yǎng)基增菌。提取2個(gè)增菌產(chǎn)物的DNA，用PCR對(duì)其QRDR進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并測(cè)4種喹諾酮對(duì)其的MI

3、C。24h觀察MIC的結(jié)果，并繼續(xù)培養(yǎng)直至試管內(nèi)液體培養(yǎng)基的顏色不再發(fā)生改變。用于測(cè)司帕沙星對(duì)2個(gè)第一代耐藥突變株MIC的2套試管中各取其中顏色發(fā)生改變且司帕沙星濃度最大的一管在瓊脂培養(yǎng)基上劃板并培養(yǎng)，再各挑1個(gè)菌落(即2個(gè)第二代耐藥突變株)用液體培養(yǎng)基增菌。提取2個(gè)增菌產(chǎn)物的DNA，用PCR對(duì)其QRDR進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并測(cè)4種喹諾酮對(duì)其的MIC。實(shí)驗(yàn)設(shè)置臨床分離株及耐藥株的對(duì)照。將Uu標(biāo)準(zhǔn)株、臨床分離株以及兩代四份耐

4、藥突變株的MIC及QRDR基因序列進(jìn)行對(duì)比，分析基因突變與耐藥的聯(lián)系。 結(jié)果：兩份第一代耐藥突變株均在編碼DNA促旋酶的基因的QRDR上發(fā)生了點(diǎn)突變，雖然具體位點(diǎn)不同，但都對(duì)司帕沙星產(chǎn)生了相對(duì)較低水平的耐藥；兩份第二代耐藥突變株則在繼承了前代的點(diǎn)突變之后，均在編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的基因的QRDR上發(fā)生了額外的點(diǎn)突變，對(duì)司帕沙星產(chǎn)生了相對(duì)較高水平的耐藥。且四份耐藥突變株對(duì)另外三種喹諾酮藥物也產(chǎn)生了耐藥性。 結(jié)論：1．編碼II

5、型拓?fù)洚悩?gòu)酶的基因ORDR突變可導(dǎo)致Uu對(duì)司帕沙星產(chǎn)生耐藥，并可對(duì)其他喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星、氟羅沙星、依諾沙星)產(chǎn)生交叉耐藥。 2．司帕沙星對(duì)Uu的DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用有選擇性，司帕沙星對(duì)Uu的首要靶酶是。DNA促旋酶。 3．DNA促旋酶單獨(dú)突變可導(dǎo)致Uu對(duì)司帕沙星發(fā)生相對(duì)較低水平的耐藥，而DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV均發(fā)生突變，則可導(dǎo)致Uu對(duì)司帕沙星相對(duì)較高水平的耐藥。 4．司帕沙星誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐