血紅素加氧酶對相對低危骨髓增生異常綜合征預(yù)后的影響及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　骨髓增生異常綜合征(Myelodysplasticsyndromes，MDS)是一組異質(zhì)性克隆性造血干細(xì)胞疾病。相對低危MDS患者骨髓微環(huán)境中一些應(yīng)激性刺激可引起造血干/祖細(xì)胞過度凋亡從而導(dǎo)致骨髓無效造血和外周血細(xì)胞數(shù)減少，由此招致的嚴(yán)重感染、出血、心力衰竭等并發(fā)癥是影響其生存期和生存質(zhì)量的主要原因。目前普遍認(rèn)為，抑制骨髓造血細(xì)胞高調(diào)亡可明顯提升骨髓造血能力，延長相對低危MDS患者生存期，從而改善預(yù)后。血紅素加氧酶

2、-1（Hemeoxygenase-1，HO-1）作為一種抗氧化應(yīng)激性蛋白酶，參與清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，抑制細(xì)胞凋亡，這種細(xì)胞保護作用可能與MAPK信號通路有關(guān)。目前研究顯示，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常參與了病態(tài)骨髓造血細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控，改善MAPK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常有助于促進(jìn)MDS骨髓正常造血。然而HO-1作為上游分子能否在相對低危MDS中調(diào)控MAPK信號通路分子活性，尚無文獻(xiàn)報道。
　　研究目的:
　　本研究旨在檢測HO-1蛋

3、白基礎(chǔ)表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系，體外應(yīng)用Hemin上調(diào)HO-1的表達(dá)檢測其對相對低危MDS患者M(jìn)APK信號通路分子活性的影響，初步探討HO-1的作用機制和臨床靶向治療的可能。
　　研究方法:
　　1.研究對象:選取70例初診相對低危MDS患者，全面采集臨床資料，其中有難治性貧血(RA)58例，難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞增多12例。以20例健康志愿者作為對照組。
　　2.標(biāo)本處理:收集70例患者與對照組骨髓標(biāo)本，用淋巴細(xì)

4、胞分離液分離骨髓單個核細(xì)胞(BMMNCs)。在70例相對低危MDS患者中隨機選取20例，每例分別給予不同終濃度（5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）的HO-1誘導(dǎo)劑Hemin體外孵育48小時后，收集細(xì)胞備用。
　　3.實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Q-RT-PCR)檢測BMMNCs中HO-1mRNA的表達(dá):檢測70例相對低危MDS患者和正常對照組HO-1mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)水平;檢測不同濃度Hemin干預(yù)后各實驗組

5、HO-1mRNA的表達(dá)水平的變化。
　　4.Westernblot檢測BMMNCs中HO-1蛋白及MAPK通路信號分子的活性:檢測70例相對低危MDS患者和正常對照組HO-1蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平;檢測不同濃度Hemin干預(yù)后各實驗組HO-1蛋白的相對表達(dá)水平的變化及MAPK通路中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化表達(dá)水平的變化。
　　5.病例隨訪:分

6、析患者病程中的病情變化直至疾病較前進(jìn)展或隨訪結(jié)束，計算患者無進(jìn)展生存(PFS)時間，分析HO-1蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平與PFS之間的關(guān)系。
　　6.統(tǒng)計學(xué)處理:利用SPSS17.0軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組間比較使用LSD-t進(jìn)行均數(shù)間的多重比較，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間兩兩比較用秩和檢驗。進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，Log-rank檢驗比較生存曲線。用Cox風(fēng)險比例模型分析HO-1對PFS的影響。用Spear

7、man法進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1.單因素生存分析顯示，HO-1高表達(dá)組患者中位PFS時間為40.8(6.4～57.6)個月，低表達(dá)組患者中位PFS時間為32.6(6.3～51.5)個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.027)。COX回歸分析顯示，HO-1蛋白的表達(dá)水平是判斷相對低危組MDS預(yù)后的獨立影響因素（HR=0.206，95％CI為0.064～0.659;P=0.008）。相關(guān)性分析顯示，相對低危組中H

8、O-1蛋白表達(dá)水平與患者外周血的血紅蛋白水平呈正相關(guān)(r=0.389，P＜0.05)。
　　2.相對低危MDS患者BMMNCs中HO-1mRNA和蛋白基礎(chǔ)表達(dá)水平與正常對照組的表達(dá)水平無顯著差異(P＞0.05)。經(jīng)不同濃度Hemin干預(yù)后，相對低危MDS患者h(yuǎn)emin干預(yù)的各實驗組中HO-1mRNA的表達(dá)水平較無Hemin干預(yù)組均有升高（P＜0.05）;經(jīng)不同濃度Hemin干預(yù)后，正常健康人各實驗組中HO-1mRNA的表達(dá)水平較無

9、Hemin干預(yù)組略有升高，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。隨著Hemin干預(yù)濃度的增加，相對低危MDS患者HO-1蛋白表達(dá)量逐漸升高，p38MAPK信號分子磷酸化表達(dá)水平逐漸降低，ERK和JNK信號分子磷酸化表達(dá)水平逐漸升高，呈濃度梯度依賴性(P＜0.05)。
　　3.在相對低危MDS中用20μmol/LZnPP-(IX)和20μmol/Lhemin共同干預(yù)后，隨著HO-1蛋白表達(dá)量的降低，p38MAPK信號分子磷酸化表達(dá)水平

10、升高，ERK和JNK信號分子磷酸化表達(dá)水平降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.HO-1蛋白的表達(dá)水平是判斷相對低危組MDS預(yù)后的獨立影響因素。上調(diào)HO-1的表達(dá)可能成為阻止MDS病情進(jìn)展的新的治療靶點。HO-1可能通過延長患者無進(jìn)展生存期、促進(jìn)紅系造血改善相對低危MDS患者的預(yù)后狀況。
　　2.在相對低危MDS中，HO-1可增加促增殖信號途徑分子ERK和JNK的活性，并抑制促凋亡信號途徑分子p38MAPK的活性