HC-ACBM聯(lián)合負(fù)壓吸引修復(fù)恒河猴骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 臨床上，面對因各種原因所致骨缺損、尤其是大塊骨缺損，一直以來沒有很理想的修復(fù)材料可供選擇，而當(dāng)前因車禍、腫瘤所導(dǎo)致的骨缺損發(fā)生率卻呈上升趨勢。骨缺損修復(fù)目前常用的支架材料主要有自體骨、同種異體骨、骨水泥、陶瓷及一些相關(guān)的衍生材料等，這些支架材料均存在不同程度的缺點(diǎn)。組織工程骨的興起為骨缺損修復(fù)支架材料指明了新的發(fā)展方向，組織工程自1987年正式提出和確定后，在種子細(xì)胞、支架材料和組織構(gòu)建技術(shù)等方面取得了明顯進(jìn)展

2、，但是仍有一些問題尚待解決和完善，組織工程骨的血管化就是其中之一。
　　 骨缺損植入修復(fù)材料后血管新生需要一個(gè)較長的過程，早期的氧和營養(yǎng)僅能靠受體的組織液滲透供應(yīng)，并且植入的材料由于機(jī)體的凝血反應(yīng)會被凝血塊包裹，從而使?jié)B透更加困難，因此其大小嚴(yán)重受到局限，這顯然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床應(yīng)用的要求。促進(jìn)組織工程骨血管化的方法常見的有：用膠原、促血管生成的生長因子等修飾支架材料；或?qū)⒊晒欠N子細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞、成血管前體細(xì)胞共培養(yǎng)等，但是效

3、果欠佳。考慮到移植的組織工程骨主要靠外周血管芽生的方式血管化，一些研究小組利用外周血管芽生的策略，提出了組織工程骨支架材料的預(yù)血管化技術(shù)：將材料和細(xì)胞復(fù)合物包埋于皮下、大網(wǎng)膜、筋膜或肌袋中待組織血管化，然后將血管化的組織移植到受區(qū)，或者將構(gòu)建的組織工程骨內(nèi)植入動(dòng)靜脈也能明顯促進(jìn)材料細(xì)胞復(fù)合物的血管化及成骨能力，但過程比較復(fù)雜，并且即便采用了這些方法，組織工程骨植入受區(qū)后，尤其是早期的血液供應(yīng)仍然靠滲透進(jìn)行，沒有完全解決血管化的難題。

4、r>　　 本課題組前期所研發(fā)的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)(Acellular bone matrix，ACBM)支架材料較好地保留了細(xì)胞外骨基質(zhì)的主要成分和完整結(jié)構(gòu)，并且采用層層自組裝技術(shù)，將肝素、殼聚糖復(fù)合在其表面，實(shí)驗(yàn)證明緩釋、抗凝效果可靠；然后在此基礎(chǔ)上聯(lián)合封閉負(fù)壓吸引技術(shù)(Vacuum Assisted closure，VAC)，使血液在早期即可在支架材料內(nèi)部實(shí)現(xiàn)持續(xù)“灌注”，為構(gòu)建的組織工程骨即時(shí)、持續(xù)提供氧和營養(yǎng)物質(zhì)。以兔和豬骨缺損

5、為模型的修復(fù)研究結(jié)果證實(shí)，HC/ACBM(Heparin-Chotison coated ACBM)材料結(jié)合封閉負(fù)壓技術(shù)使骨缺損修復(fù)支架材料植入后即刻可以獲得血液灌注，與非負(fù)壓側(cè)比較，血容量、血流量及新生血管數(shù)等均顯著增多，并且能促進(jìn)新骨形成。
　　 但是，兔和豬和人差別較大，對于這種異種來源的支架材料應(yīng)用于人還有待進(jìn)一步研究。而恒河猴的解剖結(jié)構(gòu)、生理學(xué)等方面與人高度相似，是一種較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為進(jìn)一步驗(yàn)證其安全性和有效性，

6、本實(shí)驗(yàn)首先按照ISO10993的標(biāo)準(zhǔn)檢測了這種新材料的安全性和組織相容性的系列指標(biāo)，并且在體外研究了模擬負(fù)壓吸引灌注條件下培養(yǎng)對種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合的影響，建立了恒河猴脛骨缺損的動(dòng)物模型，初步探討了HC/ACBM支架材料聯(lián)合負(fù)壓吸引對骨缺損修復(fù)過程中血流灌注和成骨的影響，為下一步的臨床研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1.HC/ACBM的生物安全性試驗(yàn)
　　 將本課題組研制的HC/ACBM材料

7、按照ISO10993的標(biāo)準(zhǔn)，制作了20％的HC/ACBM的浸提液進(jìn)行了急性、亞急性毒理試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、皮膚刺激性試驗(yàn)，以及HC/ACBM的肌肉埋植試驗(yàn)。
　　 對骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(mensenchymal stem cell，MSC)進(jìn)行分離、培養(yǎng)，然后將HC/ACBM與細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，對表面改良后的材料與MSC的粘附性進(jìn)行了研究。
　　 2.負(fù)壓吸引灌注培養(yǎng)方式對細(xì)胞與材料復(fù)合的影響
　　 制作了體外模

8、擬負(fù)壓吸引進(jìn)行細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的灌注裝置，以自制的這種裝置將MSC和HC/ACBM共培養(yǎng)，對比研究了負(fù)壓吸引灌注培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)對MSC的粘附、分布、生存、增殖等方面的影響。
　　 3.HC/ACBM結(jié)合負(fù)壓吸引修復(fù)恒河猴脛骨缺損
　　 建立恒河猴脛骨缺損的模型，以雙側(cè)自體作為對照，分別觀察了ACBM支架材料抗凝與不抗凝的比較，以及HC/ACBM聯(lián)合負(fù)壓吸引與不聯(lián)合負(fù)壓吸引的比較。利用CT及CT灌注觀察了支架材料在修復(fù)后不

9、同時(shí)間點(diǎn)的血流灌注和成骨情況。
　　 主要結(jié)果和結(jié)論：
　　 1.掃描電鏡顯示的超微結(jié)構(gòu)表明，表面改良后的HC/ACBM仍保留了天然骨的多孔三維結(jié)構(gòu)，并且HC/ACBM與MSC仍能緊密的粘附，證實(shí)HC/ACBM具有很好的粘附性。
　　 2.各項(xiàng)安全性檢測均證實(shí)HC/ACBM無明顯的毒性，具有良好的安全性和組織相容性。
　　 3.負(fù)壓吸引灌注培養(yǎng)組與靜態(tài)培養(yǎng)組的比較研究表明，負(fù)壓吸引灌注培養(yǎng)條件下，細(xì)胞在材

10、料表面和中心分布的更加均勻，TUNEL法檢測沒有發(fā)現(xiàn)粘附在材料上的細(xì)胞有明顯的凋亡發(fā)生，Brdu法檢測結(jié)果表明細(xì)胞與材料共培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞可以正常進(jìn)行增殖。
　　 4.CT灌注成像顯示，HC/ACBM時(shí)間密度曲線呈血液灌注的表現(xiàn)，而ACBM材料呈血液滲透曲線。血容量、血流量圖象顯示體內(nèi)植入HC/ACBM這種抗凝材料修復(fù)骨缺損，不僅材料周邊部分有血液灌注，材料中心出現(xiàn)血液的時(shí)間也明顯早于非抗凝材料；
　　 5.利用填充床式生物反