獨(dú)腳金內(nèi)酯在甜瓜抗列當(dāng)機(jī)理和對(duì)列當(dāng)種子萌發(fā)調(diào)控的研究.pdf

1、研究目的：
　　為了明確甜瓜獨(dú)腳金內(nèi)酯合成相關(guān)的兩個(gè)關(guān)鍵基因CmCCD7和CmCCD8在獨(dú)腳金內(nèi)酯合成中的作用，以及這兩個(gè)基因沉默后甜瓜對(duì)埃及列當(dāng)(Phlipanche aegyptiaca)種子萌發(fā)率的影響情況。同時(shí)為了明確預(yù)培養(yǎng)處理和獨(dú)腳金內(nèi)酯誘導(dǎo)后列當(dāng)種子萌發(fā)相關(guān)功能基因的表達(dá)變化。最終為埃及列當(dāng)?shù)姆乐翁峁├碚撆c技術(shù)依據(jù)。
　　研究方法：
　　通過(guò)對(duì)其他植物的獨(dú)腳金內(nèi)酯合成相關(guān)的CCD7和CCD8基因序列分析，依

2、據(jù)這兩個(gè)基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增甜瓜上這兩個(gè)基因的保守區(qū)段，再通過(guò)RACE技術(shù)獲取其側(cè)翼序列。通過(guò)ORF finder預(yù)測(cè)這兩個(gè)基因的ORF、DNAMAN分析核酸信息、Proprarm預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、Antheprot預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)、SWISSMODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)、BLASTN進(jìn)行同源比對(duì)并用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。分別對(duì)不同日齡甜瓜子葉，不同激素、不同激素濃度對(duì)甜瓜子葉的分化能力試驗(yàn)，最后測(cè)試甜瓜子葉

3、對(duì)Cef和Kan兩種抗生素的耐受能力以及對(duì)不定芽伸長(zhǎng)、生根培養(yǎng)基的篩選。選取CmCCD7和CmCCD8基因的特異性片段，構(gòu)建反向重復(fù)序列的RNAi植物表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將這兩個(gè)載體轉(zhuǎn)化甜瓜植株。對(duì)獲得的RNAi植株進(jìn)行PCR和Southern雜交驗(yàn)證。對(duì)RNAi植株的IAA、ABA含量利用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)收集、濃縮、純化甜瓜根系分泌物，用UPLC-MS/MS對(duì)5-deoxystrigol含量測(cè)定。

4、最后對(duì)RNAi甜瓜植株的分枝情況、列當(dāng)寄生數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　選取休眠種子、預(yù)培養(yǎng)后的種子和GR24處理后的列當(dāng)種子，提取RNA、構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行 RT-PCR驗(yàn)證、篩選和統(tǒng)計(jì)；并對(duì)獲得的Unigenes在 NR、Swissprot、GO、COG、KOG和KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋。對(duì)差異基因信息GO功能分析、KEGG代謝通路分析。對(duì)儲(chǔ)存物質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)合成代謝相關(guān)基因進(jìn)行了分析。最后，對(duì)激素

5、合成代謝的相關(guān)基因進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證和分析，并對(duì)相應(yīng)的激素水平進(jìn)行了測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　甜瓜CmCCD7和CmCCD8基因的cDNA全長(zhǎng)分別為2346 bp和2153 bp，分別包含了長(zhǎng)度為1833 bp(KF381339.1)和1656 bp(KJ473491.1)的開(kāi)放閱讀框。CmCCD7和CmCCD8在甜瓜“黃旦子”的根、莖、葉、芽中均有表達(dá)，其中以根中的表達(dá)量最高，芽中最少。整體進(jìn)行對(duì)比后， CmCCD8基因

6、的相對(duì)表達(dá)量都要高于CmCCD7基因。CmCCD7和CmCCD8編碼的蛋白質(zhì)分子量分別為68.60 kD和61.24 kD。CmCCD7和CmCCD8蛋白與己知蛋白質(zhì)RPE65的三級(jí)結(jié)構(gòu)有較高的同源性。
　　兩天葉齡子葉為最佳外植體，分化率最高。而且，不定芽的分化主要發(fā)生在臨近下胚軸子葉基部一側(cè)的傷口邊緣。6-BA與IAA濃度比值越大，越有利于不定芽的分化；6-BA濃度為1.2 mg/l時(shí)，誘導(dǎo)效率相對(duì)較高。在不含激素的MS培養(yǎng)基

7、中外植體基部產(chǎn)生許多不定根。在不同濃度范圍的Cef下，不定芽的誘導(dǎo)率并無(wú)顯著差異，而且濃度500 mg/l的Cef對(duì)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)抑制效果較好，因此，以500 mg/l為最佳濃度用于侵染后的脫菌和抑菌過(guò)程。在Kan濃度達(dá)到100 mg/l時(shí)，子葉不能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，故將Kan篩選壓力定為100 mg/l。
　　進(jìn)行PCR和Southern雜交檢測(cè)后，分別成功獲得13和8轉(zhuǎn)基因植株。挑取RNAi-CmCCD7和RNAi-CmCCD8單克

8、隆植株各一株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。RNAi植株的分枝數(shù)和IAA的水平與非轉(zhuǎn)基因的植株的分枝數(shù)量和IAA水平都非常接近。ABA在非轉(zhuǎn)基因和rnai-73植株中顯著高于比rnai-84植株中。但是并沒(méi)有檢測(cè)到5-deoxystrigol，即使是在非轉(zhuǎn)基因甜瓜中。無(wú)論是野生型還是RNAi植株列當(dāng)寄生率都非常高，平均每株植株有100個(gè)列當(dāng)寄生。但 rnai-84植株上的列當(dāng)寄生率比rnai-73和野生型植株的顯著降低。
　　轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共得到19.

9、79Gb Clean數(shù)據(jù)，各樣品Q(chēng)30堿基百分比均大于88.36％。在各核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到53,921條Unigenes。經(jīng)過(guò)RT-PCR驗(yàn)證后，對(duì)差異基因分析發(fā)現(xiàn)，其中休眠種子和預(yù)培養(yǎng)種子中的顯著差異基因有694個(gè)，預(yù)培養(yǎng)種子和GR24處理后的種子中的顯著差異表達(dá)基因有4,630個(gè)。對(duì)三個(gè)樣品中的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析，將這些差異表達(dá)基因劃分到9個(gè)Cluster中。三個(gè)不同萌發(fā)階段的差異基因參與了96個(gè)代謝通路。
　　在預(yù)培養(yǎng)

10、階段有GA和BR合成的相關(guān)基因被激活，且兩種激素的含量也同時(shí)升高，與基因表達(dá)情況一致。從轉(zhuǎn)錄組注釋的數(shù)據(jù)中找到了3個(gè)與獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)接收相關(guān)的基因，MAX2和2個(gè)KAI2-like基因。分析后發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)刺激物受體的相關(guān)基因已經(jīng)在這個(gè)階段得到表達(dá)。在GR24處理后，GA、ABA、乙烯和BRs合成代謝的許多相關(guān)基因也發(fā)生了顯著變化，而且這些變化與其含量的變化一致。在不同激素處理試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)氟啶酮這種類(lèi)胡蘿卜素合成抑制劑可以刺激列當(dāng)種子的萌發(fā)