肉毒毒素內(nèi)肽酶活性體外分析方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、肉毒毒素是世界上已知毒性最強(qiáng)的物質(zhì),肉毒中毒事件時(shí)有發(fā)生,主要以食物污染等方式出現(xiàn)。目前主要使用肉毒毒素馬血清對(duì)肉毒中毒進(jìn)行治療,易產(chǎn)生免疫反應(yīng)副作用,同時(shí)對(duì)進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的毒素效果很差。因此研發(fā)可進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的小分子抑制劑是治療肉毒毒素藥物開發(fā)的主要方向。但現(xiàn)在還沒有合適的小分子抑制劑能用于肉毒中毒的治療,合適的分析方法的建立對(duì)加快抑制劑的篩選和活性驗(yàn)證具有重要意義。本論文建立了兩種肉毒毒素內(nèi)肽酶活性的體外分析方法,同時(shí)利用體外分析法

2、篩選得到了有顯著抑制內(nèi)肽酶活性的化合物,主要進(jìn)行了三部分的研究。
　　具體如下：
　　第一部分：基于電泳的內(nèi)肽酶分析法的建立及條件優(yōu)化
　　我們建立了能針對(duì)多型肉毒毒素分析的內(nèi)肽酶分析法。我們?cè)O(shè)計(jì)和構(gòu)建了一個(gè)適用于多型肉毒毒素分析的底物融合蛋白SNVP:從N端到C端依次為SNAP-25殘基1-206,6個(gè)組氨酸linker序列,VAMP殘基1-94,6個(gè)組氨酸標(biāo)簽。成功構(gòu)建工程菌pET-22b-SNVP/Rosetta

3、(DE3),純化獲得純度為95％的重組SNVP;利用A,B毒素輕鏈ALc和BLc對(duì)其進(jìn)行反應(yīng),證明重組SNVP具有能被ALc和BLc切割的底物活性。
　　對(duì)以SNVP為底物的基于電泳的內(nèi)肽酶分析法的緩沖液、pH、反應(yīng)溫度和DTT等條件進(jìn)行優(yōu)化得到:最適緩沖液為Hepes緩沖液;最適的pH為6.5-7.5;最適反應(yīng)溫度為37℃;最適的DTT濃度為2.5-5mM,進(jìn)一步對(duì)ALc切割底物SNVP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定得到Km為6.4±0.4m

4、M和kcat值為39±1.5s-1;類似地得到BLc切割底物SNVP的Km和kcat值分別為5.9±0.2mM和45±1.2s-1。
　　第二部分:基于雙熒光報(bào)告分子的內(nèi)肽酶分析法的建立及條件優(yōu)化
　　為了滿足高通量抑制劑篩選的要求,我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于雙熒光報(bào)告分子的內(nèi)肽酶分析方法。首先,成功構(gòu)建了針對(duì)A型和B型毒素的雙熒光報(bào)告分子的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-CYA和pET-22b-CYB;純化獲得純度為90%左右的雙熒

5、光報(bào)告分子CYA和CYB,利用ALc和BLc分別對(duì)CYA和CYB進(jìn)行反應(yīng),證明CYA只能被ALc識(shí)別切割而不能被BLc切割,同樣CYB只能被BLc識(shí)別切割而不能被ALc切割,說明雙熒光報(bào)告分子具有型特異專屬特征。
　　檢測(cè)ALc酶切CYA的發(fā)射波長(zhǎng)比率(528/485)的變化,標(biāo)準(zhǔn)化為CYA的變化,與SDS-PAGE分析CYA的直接變化進(jìn)行相關(guān)分析,兩種方法得到的結(jié)果呈線性相關(guān)(R2=0.96),說明可以用熒光波長(zhǎng)528與485比

6、值的變化作為底物變化的指標(biāo),并可通過標(biāo)準(zhǔn)化確定為底物量的變化。對(duì)基于雙熒光報(bào)告分子的內(nèi)肽酶分析法的底物濃度和酶濃度、動(dòng)態(tài)檢測(cè)間隔時(shí)間、檢測(cè)持續(xù)時(shí)間等條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn):CYA合適的范圍為(0.5-32μM);CYB合適的范圍為(0.2-32μM);合適的動(dòng)態(tài)檢測(cè)間隔時(shí)間為2min;持續(xù)檢測(cè)合適的時(shí)間為(30min-120min)。CYA在內(nèi)肽酶ALc作用下隨時(shí)間發(fā)射波長(zhǎng)比率(528/485)變化范圍為0.5-0.9之間;CYB在內(nèi)肽酶BLc作

7、用下隨時(shí)時(shí)間發(fā)射波長(zhǎng)比率(528/485)變化范圍為0.5-1.5之間。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定ALc切割底物CYA的值Km為2.33±0.21μM和kcat值為5±0.4s-1;類似地得到BLc切割底物CYB的Km和kcat值分別為17.6±2.6μM和4.16±0.28s-1。
　　第三部分:內(nèi)肽酶體外分析方法在小分子抑制劑篩選中的應(yīng)用
　　利用基于雙熒光報(bào)告分子的內(nèi)肽酶分析法對(duì)16個(gè)化合物進(jìn)行篩選。測(cè)試10μg的化合物對(duì)2nM

8、BLc酶解底物CYB的影響,得到抑制率大于20%的有13個(gè),抑制程度從大到小分別為B0,B23,B20,B3,B12,B8,B21,B9,B26,B2,B24,B18,B10,其中B0具有最強(qiáng)的抑制作用,抑制率為95.5±2.9%,其次是B23,抑制率為55.4±2.1%。
　　同時(shí)利用基于電泳的內(nèi)肽酶方法分析了16個(gè)化合物對(duì)BLc的抑制作用,通過電泳結(jié)果直觀可以看出在相同劑量下B23的抑制效果最好,幾乎完全抑制BLc酶活,其次是

9、B0,其他化合物也表現(xiàn)出不同程度的抑制效果。
　　篩選得到的化合物對(duì)小鼠肉毒攻毒的保護(hù)作用測(cè)試發(fā)現(xiàn):化合物與絕對(duì)致死劑量的B型毒素共同孵育后腹腔途徑攻毒,不同的化合物提供了不同程度的保護(hù)效果,B0的保護(hù)作用最強(qiáng),具有呈劑量依賴性,40μg,60μg,80μg的B0可以對(duì)受試小鼠分別提供0%(0/5),20%(1/5),60%(3/5)的保護(hù)率,當(dāng)對(duì)每只小鼠的化合物用量達(dá)到200μg(13.3mg/kg)時(shí),B0可以對(duì)小鼠提供完全保