水稻葉片淀粉積累及早衰突變體esl9的鑒定與基因定位.pdf

1、葉片作為植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要器官，葉片早衰將直接影響植株光合作用，生長(zhǎng)發(fā)育等代謝活動(dòng)，從而影響產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀。本研究利用甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate，EMS)誘變秈型三系保持系西農(nóng)1B，獲得了一個(gè)新的可能因葉片淀粉過度積累而導(dǎo)致的水稻早衰突變體esl9(early senescence leaf9)，對(duì)該突變體進(jìn)行了表型鑒定、農(nóng)藝性狀調(diào)查、細(xì)胞學(xué)觀察、光合色素含量、衰老相關(guān)生理

2、指標(biāo)測(cè)定和衰老相關(guān)基因的表達(dá)分析，同時(shí)對(duì)葉片進(jìn)行了淀粉含量測(cè)定和碘-碘化鉀染色，以及淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析，并對(duì)該突變基因進(jìn)行了初步定位和精細(xì)定位，從而為ESL9基因的克隆及功能分析奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1表型及主要農(nóng)藝性狀
　　該突變體苗期葉片呈淡綠色，分蘗期開始除心葉外的葉片從葉尖開始黃化衰老，逐漸延伸至葉中上部，基部保持綠色，該性狀一直持續(xù)到成熟。與野生型相比，突變體 esl9的株高、穗長(zhǎng)和千粒重顯著

3、降低，有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率及一次枝梗數(shù)極顯著降低，尤其是每穗實(shí)粒數(shù)，僅為野生型的17.35％。
　　2光合色素和凈光合速率
　　與野生型相比，苗期和分蘗期，突變體 esl9的光合色素含量均有不同程度的降低，其中分蘗期的倒二葉下降幅度最大，四種光合色素含量均不及野生型倒二葉的一半。并且，突變體esl9的凈光合速率極顯著低于野生型。
　　3細(xì)胞學(xué)觀察
　　細(xì)胞學(xué)觀察顯示，突變體 esl9的葉綠體中充

4、斥著大量淀粉顆粒，葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，自發(fā)熒光減弱。
　　4葉片淀粉含量及淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)
　　組織化學(xué)分析表明，突變體 esl9葉片中積累了大量的淀粉顆粒，倒二葉積累最嚴(yán)重；同時(shí)測(cè)定倒二葉淀粉含量發(fā)現(xiàn)，突變體 esl9晚上和早上淀粉含量均極顯著高于野生型，但突變體早上含量低于晚上，說明該部位葉片的淀粉存在一個(gè)積累過程，晚上也能分解，但不能完全分解，多余的淀粉逐漸積累并最終導(dǎo)致過度積累；qRT-PCR結(jié)果顯示，淀粉合成途徑

5、相關(guān)基因上調(diào)，磷酸丙糖(TP)分配途徑基因下調(diào)，淀粉降解途徑基因上調(diào)，推測(cè)基因突變可能改變了TP的分配途徑，促使葉片中淀粉合成增多，同時(shí)過多的淀粉促進(jìn)其分解，但是分解速率不及合成速率，故導(dǎo)致葉片過度積累淀粉。
　　5衰老相關(guān)的生理指標(biāo)
　　與野生型相比，突變體esl9的保護(hù)酶系統(tǒng)中SOD和CAT活性降低，POD活性略微升高；O2￣、·OH和H2O2等活性氧不能被清除，含量上升。
　　6衰老相關(guān)基因的表達(dá)
　　衰老

6、相關(guān)基因的表達(dá)分析表明，突變體esl9中衰老正調(diào)控因子表達(dá)上調(diào)，負(fù)調(diào)控因子表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步加速了葉綠素的降解、葉綠體的破壞，自由基積累，促進(jìn)衰老。
　　7遺傳分析
　　以56S和esl9配制雜交組合，F(xiàn)1群體葉片均表現(xiàn)早衰黃化，F(xiàn)2群體中表現(xiàn)出明顯的性狀分離，其中黃化植株1941株，綠色植株596株，其分離比例符合3:1，表明esl9受一對(duì)顯性核基因的控制。
　　8基因定位及候選基因
　　通過初步定位和精細(xì)定位，

7、將目的基因ESL9定位于第11染色體標(biāo)記S11-110與S11-87之間，物理距離為304.9 kb，該區(qū)間內(nèi)包含41個(gè)注釋基因，有9個(gè)編碼表達(dá)蛋白，4個(gè)編碼富含亮氨酸重復(fù)家族蛋白，2個(gè)編碼托品酮還原酶Ⅱ，1個(gè)編碼假定蛋白，其他編碼轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)座子蛋白。沒有在該區(qū)間發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的衰老相關(guān)基因，通過對(duì)其中4個(gè)含有NB-ARC結(jié)構(gòu)域、編碼富含亮氨酸蛋白、參與細(xì)胞程序性死亡的基因進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，并未發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因在野生型和突變體中存在差異，為下一