番茄青枯病拮抗菌的篩選、鑒定和應用研究.pdf

1、番茄青枯病是一類危害嚴重的世界性土傳細菌病害，它的有效防治已經成為番茄生產中亟待解決的難題。本研究從生物防治的角度出發(fā)，分離篩選了對番茄青枯病有拮抗作用的菌株，通過溫室盆栽試驗和田間小區(qū)試驗進行了防治效果和田間應用效果評價。旨在為高效芽孢桿菌的研制和使用提供理論依據和技術支持。 主要研究內容有以下幾個方面： 1.從山東壽光和蒼山不同種植年限的蔬菜大棚中分離得到的45株菌株以及中國農業(yè)微生物菌庫中保存的19株菌株中，利用點

2、接法篩選到14株對茄科勞爾氏菌有拮抗作用的菌株，然后通過牛津杯法復篩得到6株抑菌效果較好的菌株。通過溫室盆栽試驗表明拮抗菌X10的防治效果最好，液體菌劑防治效果達到了81.8％，固體菌劑防治效果達到了65.4％。 2.對番茄青枯病拮抗菌X10進行了形態(tài)學特征、生理生化特征測定，結果表明它與側孢短芽孢桿菌種的特征一致。測定了菌株的16SrDNA序列并根據其構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，X10與側孢短芽孢桿菌形成一個類群，序列同

3、源性為99％。因此將X10鑒定為側孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)。 3.從側孢短芽孢桿菌X10發(fā)酵液中提取的拮抗蛋白粗提液具有抑制茄科勞爾氏菌生長的效果，該抗菌蛋白粗提液具有良好的熱穩(wěn)定性，能耐90℃的高溫；用蛋白酶處理，其抑菌活性受胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K的影響；對氯仿敏感；隨著紫外照射時間的延長，活性受到影響；拮抗物質25℃保存，活性28d內基本不變；作用活性pH(pH5.0～11.0

4、)范圍較寬，這對于芽孢桿菌用于生物肥料的生產和保藏具有一定的理論指導作用。 4.根據溫室盆栽試驗的結果，制備側孢短芽孢桿菌X10的固體菌劑，在山東萊陽趙旺莊鄉(xiāng)露地蔬菜栽培區(qū)和山東肥城科技示范園的蔬菜大棚里進行了小區(qū)試驗，對田間應用效果進行了測定。結果表明固體菌劑的兩種接種量對番茄青枯病的防治效果分別達到了58.42％和68.68％，固體菌劑蔬菜大棚施用能夠促進番茄植株生長和增加產量。 5.提取了側孢短芽孢桿菌X10的基因

5、組DNA，以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因，以啟動子探針pUC19-GFP為載體，通過鳥槍法在大腸桿菌DH5a中構建了X10的啟動子文庫。通過篩選獲得了14個陽性克隆，編號為P1～P14。對P2、P3、P6、P9、P10、P13和P14克隆中的重組質粒的插入片段進行了測序和在線啟動子預測。結果顯示插入片段Ps3和Ps6具有典型的原核啟動子的特征，其它五個插入片段則沒有典型的原核啟動子特征。將Ps6插入到穿梭載體pNW33N的多克隆位點