CD15及CD133在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤表達(dá)及其臨床意義的探討.pdf

1、一、研究背景
　　 腦腫瘤干細(xì)胞(BTSCs)是指腦腫瘤組織中存在著一小群具有很強(qiáng)的自我更新能力、分化功能強(qiáng)、能再成瘤、對(duì)常規(guī)的放化療有很強(qiáng)抵抗力的細(xì)胞，是腦腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的主要原因，其數(shù)量可能與腫瘤的惡性程度及預(yù)后存在相關(guān)性?；谀X腫瘤干細(xì)胞的靶向治療是目前研究的熱點(diǎn)之一。迄今為止，腦腫瘤公認(rèn)的干細(xì)胞特征的細(xì)胞(包括BTSCs)表面標(biāo)記物是CD133。最初研究報(bào)道認(rèn)為CD133是腦腫瘤干細(xì)胞的代名詞，或至少是一個(gè)先決條件

2、。然而，最近一系列研究報(bào)道表明，CD133可能不是這些細(xì)胞的絕對(duì)指標(biāo)。因?yàn)镃D133對(duì)BTSCs具有高選擇性，而非高特異性，它同時(shí)也表達(dá)于胚胎及成人中樞神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞。CD133屬于糖復(fù)合物，由于糖復(fù)合物通常都定位于細(xì)胞表面，它們的表達(dá)通常會(huì)隨著細(xì)胞的發(fā)育發(fā)生大幅度的改變。此外，在正常的發(fā)育過(guò)程中，如果腫瘤起源于干/祖細(xì)胞不同點(diǎn)，從不同系列的膠質(zhì)瘤得來(lái)的腦腫瘤干細(xì)胞可能有不同的的免疫表型及其獨(dú)特的干細(xì)胞標(biāo)記物。

3、與造血干細(xì)胞類(lèi)似的是，腦腫瘤干細(xì)胞的確定需要相應(yīng)標(biāo)記物的聯(lián)合應(yīng)用。因此尋求新的腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物就非常必須且迫切。2009年先后有學(xué)者報(bào)道在老鼠的髓母細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)一種具干細(xì)胞特征的細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)表面標(biāo)記物CD15。研究人員通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)表明CD15可以用來(lái)作為從腦腫瘤CD133-的細(xì)胞得來(lái)的腦腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(包括干細(xì)胞、祖細(xì)胞)的標(biāo)記。腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD15及CD133為抗腫瘤治療提供了新思路和可能的治療靶點(diǎn)，尤其CD15作

4、為新發(fā)現(xiàn)的腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，可能為腦腫瘤基于腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的治療提供一個(gè)新的切入點(diǎn)。本研究利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD15和CD133的表達(dá)，探討腫瘤組織中CD15和CD133陽(yáng)性細(xì)胞的存在、分布和臨床意義，為腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。
　　 二、研究目的
　　 檢測(cè)CD15及CD133在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，探討兩種標(biāo)記物之間的相關(guān)聯(lián)系及其臨床意義。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法

5、r>　　 1、材料與方法
　　 標(biāo)本的收集:80例膠質(zhì)瘤標(biāo)本來(lái)源于南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院病理科2008年至2010年存檔蠟塊。所有標(biāo)本均經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師復(fù)查確診，有詳細(xì)臨床、病理資料和隨訪資料。男45例，女35例，平均年齡35歲。嚴(yán)格按照WHO(2007)腦腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分類(lèi)、分級(jí):Ⅰ級(jí)10例，均為神經(jīng)元和混合性神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤;Ⅱ級(jí)31例，其中少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤13例，神經(jīng)元和混合性神經(jīng)元細(xì)胞腫瘤18例;Ⅲ級(jí)9例，其

6、中間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤7例，神經(jīng)元和混合性神經(jīng)元細(xì)胞腫瘤2例;Ⅳ級(jí)30例，其中髓母細(xì)胞瘤10例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤20例。Ⅰ-Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ-Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤，其中高級(jí)別膠質(zhì)瘤39例，低級(jí)別膠質(zhì)瘤41例。
　　 采用非生物素免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中CD15和CD133的表達(dá)。使用Image-Pro Plus6.0圖像分析處理軟件計(jì)算CD15與CD133陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度(integrated optical densi

7、ty，IOD)，比較不同級(jí)別膠質(zhì)瘤CD15+細(xì)胞與CD133+細(xì)胞IOD值有無(wú)差別，同時(shí)進(jìn)行CD)15+細(xì)胞與CD133+細(xì)胞IOD值相關(guān)分析。
　　 2、實(shí)驗(yàn)步驟
　　 石蠟切片脫蠟和水化后，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。蒸餾水沖洗2次，每次5min，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered saline，PBS)浸泡2次共10 min。加入過(guò)氧化物阻斷劑50-100μl阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化

8、物酶，室溫孵育10min。PBS液中沖洗3min×3次;甩去PBS液，滴加強(qiáng)力阻斷劑，室溫孵育10min;滴加一抗CD15或CD133(用PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照)，室溫孵育2小時(shí);PBS液中沖洗5min×3次;甩去PBS液，滴加Super Enhancer液，室溫孵育15-20min;PBS液中沖洗3min×3次;甩去PBS液，滴加Polymer HRP試劑，室溫孵育15-30min;PBS液中沖洗3min×3次;甩去PBS液，

9、每張片滴加2滴新配制的DAB溶液(按說(shuō)明書(shū)配制)，3～5min后顯微鏡下觀察顯色情況，充分顯色后終止反應(yīng)，流動(dòng)自來(lái)水充分沖洗15min，蘇木素復(fù)染1min，酒精分化2秒鐘，流動(dòng)自來(lái)水中沖洗10min以上，干燥，二甲苯透明，封片。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0軟件包，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每張切片選取具有代表性的腫瘤區(qū)域，在高倍鏡(400×)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，使用Image-Pro Plus6.0

10、圖像分析處理軟件計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度(注:計(jì)算CD15陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度時(shí)去除CD15陽(yáng)性中性粒細(xì)胞，計(jì)算CD133陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度時(shí)去除CD133陽(yáng)性血管)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用中位數(shù)(Median，M)表示。對(duì)CD15+細(xì)胞與CD133+細(xì)胞在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的積分光密度值(IOD)組間的比較采用兩獨(dú)立樣本比較秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon秩和檢驗(yàn));CD15+細(xì)胞與CD133+細(xì)胞IOD之間的相關(guān)性分析采用Spearman法，P＜0.05

11、為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 四、結(jié)果
　　 1、CD15及CD133在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)形態(tài)多樣，基本形態(tài)主要如下:CD15陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)有點(diǎn)狀陽(yáng)性、核周圈狀陽(yáng)性、短簇狀陽(yáng)性及長(zhǎng)簇狀陽(yáng)性;CD133陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)有胞漿和胞突狀陽(yáng)性(有單極、雙極及多極)、核周胞漿空泡陽(yáng)性、短簇狀陽(yáng)性及長(zhǎng)簇狀陽(yáng)性。
　　 2、CD15及CD133的陽(yáng)性表達(dá)在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織的分布特征如下:CD15與CD133在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤均有表達(dá)，且C

12、D15+細(xì)胞與CD133+細(xì)胞的分布有一定規(guī)律性，CD15及CD133陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)增高而增高。低級(jí)別組CD133及CD15陽(yáng)性細(xì)胞較少，多散發(fā)存在，CD133及CD15陽(yáng)性壁龕較少;高級(jí)別組CD133及CD15陽(yáng)性細(xì)胞多，聚集呈巢狀分布，且大部分分布于血管壁的周?chē)?，繞血管放射狀分布，CD133及CD15陽(yáng)性壁龕比較多。于CD133染色中，可見(jiàn)CD133陽(yáng)性血管，這些CD133陽(yáng)性血管的陽(yáng)性CD133細(xì)胞考慮為內(nèi)皮前體

13、細(xì)胞;還可見(jiàn)CD133染色的特殊圖像，表現(xiàn)為假柵欄狀壞死及排列成軌道分布的圖像，前者的壞死位于CD133陽(yáng)性細(xì)胞形成的假柵欄里面，這種壞死一般為不完全性壞死，后者為CD133陽(yáng)性細(xì)胞圍繞著血管排列成軌道狀;含有肥胖細(xì)胞成分的膠質(zhì)瘤尚可見(jiàn)大量肥胖細(xì)胞CD133陽(yáng)性。
　　 3、不同級(jí)別組膠質(zhì)瘤中CD15+細(xì)胞與CD133+細(xì)胞IOD值在不同級(jí)別組膠質(zhì)瘤中CD15+細(xì)胞IOD值分別為1879.96(高級(jí)別組)及430.43(低級(jí)別組

14、);在不同級(jí)別組膠質(zhì)瘤中CD133+細(xì)胞IOD值分別為3218.35(高級(jí)別組)及473.11(低級(jí)別組)，不同級(jí)別組膠質(zhì)瘤中CD15+細(xì)胞與CD133+細(xì)胞IOD值差異均有顯著性(z=-3.432, p=0.001;z=-4.192, p=0.000);
　　 4、CD15與CD133在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤表達(dá)的相關(guān)性隨CD133陽(yáng)性表達(dá)升高CD15陽(yáng)性表達(dá)也有逐漸增高的趨勢(shì)。經(jīng)Spearman直線相關(guān)分析表明，CD15+細(xì)胞與CD

15、133+細(xì)胞IOD值呈顯著正相關(guān)(r=0.535，p=0.000)。
　　 五、結(jié)論
　　 1、CD15與CD133在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤均有表達(dá)，CD15及CD133陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及壁龕隨膠質(zhì)瘤病理級(jí)別增高而增高。并且，不同級(jí)別組膠質(zhì)瘤中CD15+細(xì)胞(p=0.001)與CD133+細(xì)胞(p=0.000) IOD值差異均有顯著性。
　　 2、CD15及CD133表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系。經(jīng)Spearman直線相關(guān)分析表明，C