丙酸睪酮改善老年大鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動行為及VMAT2的參與.pdf

1、本研究通過網(wǎng)格棒下降實驗(Descending a wire mesh pole)、楔形板行走實驗(Tapered beam walking test)和粘附物去除實驗(Adhesiveremoval test)，檢測鼻腔(Intranasal administration)或皮下(Subcutaneousinjection)給予TP對大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動行為的影響;通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測鼻腔或皮下給予TP對大鼠尾殼核內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響

2、;通過RT-PCR技術(shù)，免疫印跡以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測鼻腔或皮下給予TP對大鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能體系中VMAT2表達(dá)的影響;通過給予VMAT2阻斷劑利血平，探討TP對上述指標(biāo)的影響是否與VMAT2相關(guān);在細(xì)胞水平探討TP對多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制是否通過雄激素受體途徑實現(xiàn)的。
　　本文主要分五部分展開研究：
　　第一部分 丙酸睪酮改善老年大鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動行為
　　目的:探討長期鼻腔或皮下TP替代對大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動行為的影響

3、。
　　方法:通過網(wǎng)格棒下降、楔形板行走和粘附物去除實驗檢測大鼠協(xié)同運(yùn)動行為。
　　結(jié)果:1.通過網(wǎng)格棒下降實驗發(fā)現(xiàn)，24Mon大鼠網(wǎng)格棒停留時間較6Mon大鼠短(P＜0.01);長期TP處理后老年大鼠停留時間較24Mon組延長（鼻腔95.21％、皮下55.02％）(P＜0.01)差異顯著。
　　2.通過楔形板行走實驗發(fā)現(xiàn)，24Mon大鼠雙后肢楔形板評分較6Mon大鼠高(P＜0.01);長期TP處理后老年大鼠雙后肢評分

4、較24Mon組降低（左后肢，鼻腔22.56％、皮下11.24％;右后肢，鼻腔19.33％、皮下13.32％）（P＜0.01）。
　　3.通過粘附物去除實驗發(fā)現(xiàn)，24Mon組大鼠鼻左、右側(cè)粘附物去除時間較6Mon大鼠長(P＜0.01);長期TP處理后老年大鼠鼻部雙側(cè)粘附物去除時間較24Mon組縮短（左側(cè):鼻腔39.29％、皮下38.29％;右側(cè):鼻腔50.11％、皮下40.64％）(P＜0.01)。24Mon組大鼠兩前肢粘附物去除時

5、間較6Mon大鼠長(P＜0.01);長期TP處理后老年大鼠兩前肢粘附物去除時間分別較24Mon組縮短（左側(cè):鼻腔48.31％、皮下57.63％;右側(cè):鼻腔49.81％、皮下61.34％）(P＜0.01)。
　　結(jié)論:1.老年大鼠表現(xiàn)協(xié)調(diào)運(yùn)動行為缺陷。
　　2.老年大鼠長期給予TP替代后，協(xié)調(diào)運(yùn)動行為缺陷改善。
　　3.老年大鼠鼻腔給予TP對協(xié)調(diào)運(yùn)動行為缺陷的改善優(yōu)于皮下給藥。
　　第二部分 丙酸睪酮增強(qiáng)老年大鼠黑

6、質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的功能活動
　　目的:探討長期鼻腔或皮下TP替代對大鼠尾殼核DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響。
　　方法:通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測大鼠尾殼核內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物的含量。
　　結(jié)果:24Mon組大鼠CPu處DA及其代謝產(chǎn)物水平均較6Mon組明顯改變，DA、DOPAC和HVA含量(P＜0.01)明顯降低;DOPAC+HVA/DA、DOPAC/DA和HVA/DA比值（P＜0.01）明顯升高;給予TP長期處理后，老

7、年大鼠DA及其代謝產(chǎn)物含量均較24Mon組明顯改變，其中DA（鼻腔131.46％、皮下53.87％）、DOPAC（鼻腔38.24％、皮下27.82％）和HVA（鼻腔33.25％、皮下15.79％）(P＜0.01)明顯升高;DOPAC+HVA/DA（鼻腔35.79％、皮下18.61％）、DOPAC/DA（鼻腔35.24％、皮下16.48％）和HVA/DA（鼻腔37.26％、皮下24.07％）(P＜0.01)明顯降低，鼻腔給藥組基本恢復(fù)到6

8、Mon組水平(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.老年大鼠尾殼核內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量減少。
　　2.老年大鼠長期TP替代后，尾殼核內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量增加，暗示黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的活性增強(qiáng)。
　　3.老年大鼠鼻腔給予TP對尾殼核內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的改善優(yōu)于皮下給藥。
　　第三部分 丙酸睪酮增加老年大鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元VMAT2的表達(dá)
　　目的:探討長期鼻腔或皮下TP

9、替代對老年大鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元VMAT2表達(dá)的影響。
　　方法:通過RT-PCR檢測大鼠黑質(zhì)內(nèi)VMAT2 mRNA的RQ值，Westernblot檢測大鼠黑質(zhì)和尾殼核內(nèi)VMAT2/GAPDH的比值，免疫組化法檢測老年大鼠黑質(zhì)和尾殼核內(nèi)VMAT2的平均光密度值和神經(jīng)元數(shù)目。
　　結(jié)論:
　　1.老年大鼠黑質(zhì)內(nèi)VMAT2-ir免疫陽性細(xì)胞數(shù)目減少，給予TP后增加。
　　2.老年大鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元

10、VMAT2 mRNA和VMAT2蛋白表達(dá)減少。
　　3.老年大鼠長期給予TP替代后，能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提高黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元VMAT2表達(dá)。
　　4.老年大鼠鼻腔給予TP對黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元VMAT2的改善優(yōu)于皮下給藥。
　　第四部分 VMAT2參與丙酸睪酮對老年大鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動行為和黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元功能活動的改善
　　目的:探討老年大鼠TP長期替代后協(xié)調(diào)運(yùn)動行為和黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神

11、經(jīng)元的功能活動明顯改善，是否與VMAT2表達(dá)增多相關(guān)。
　　方法:應(yīng)用VMAT2長效特異性抑制劑利血平預(yù)先處理老年大鼠，然后給予TP皮下替代治療。通過網(wǎng)格棒下降，楔形板行走和粘附物去除實驗檢測大鼠協(xié)同運(yùn)動行為，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測大鼠尾殼核內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物的水平，RT-PCR檢測大鼠黑質(zhì)內(nèi)VMAT2 mRNA的RQ值，Western blot檢測大鼠黑質(zhì)和尾殼核內(nèi)VMAT2/GAPDH的比值。
　　結(jié)論:1.利血平抑制VMAT

12、2的功能、減少DA及其代謝產(chǎn)物的含量、提高DA代謝產(chǎn)物與DA的比值和損傷協(xié)調(diào)運(yùn)動行為。
　　2.TP對老年大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動行為和黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元功能的影響可能部分通過VMAT2實現(xiàn)的。
　　第五部分 睪酮提高SH-SY5Y細(xì)胞MAT2表達(dá)與雄激素受體相關(guān)
　　目的:在細(xì)胞水平探討睪酮(Testosterone，T)提高VMAT2表達(dá)和神經(jīng)保護(hù)作用是通過雄激素受體(Androgen receptor，AR)實現(xiàn)的<

13、br>　　方法:RA/TPA分化的SH-SY5Y細(xì)胞作為DA神經(jīng)元體外研究模型;利用H2O2作為ROS激發(fā)劑;預(yù)先給予T和AR阻斷劑氟他胺(Flutamide，F(xiàn)lu)處理，通過MTT和LDH檢測SH-SY5Y細(xì)胞損傷程度，通過免疫熒光和免疫印記檢測VMAT2表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:1.RA/TPA分化SH-SY5Y細(xì)胞后，出現(xiàn)胞體變圓變小，突起增長等形態(tài)學(xué)變化。NeuN檢測結(jié)果顯示RA/TPA分化細(xì)胞NeuN的表達(dá)明顯（P＜0.

14、01）高于未分化細(xì)胞。
　　2.MTT和LDH檢測結(jié)果顯示，對照(Con)組、睪酮處理(T)組和睪酮和氟他胺處理(T+F)組三組間細(xì)胞活性沒有明顯變化(P＞0.05)，過氧化氫處理(H)組、睪酮和過氧化氫處理(T+H)組和睪酮、氟他胺和過氧化氫處理(T+F+H)組三組細(xì)胞活性均較Con、T和T+F三組降低(P＜0.01)，H和T+F+H組細(xì)胞活性低于T+H組(P＜0.01)。
　　3.免疫熒光結(jié)果顯示:Con和T+F組間AO

15、D值沒有明顯差異(P＞0.05)，H、T和T+F+H三組間AOD值沒有明顯差異(P＞0.05)，H、T和T+F+H三組的AOD值明顯高于Con和T+F組(P＜0.01)，T+H組明顯高于其余5組（P＜0.01）。
　　4.免疫印記結(jié)果顯示:Glyco-VMAT2與GAPDH免疫印跡條帶相對吸光度比值，H、T和T+F+H三組間沒有明顯差異(P＞0.05)，H、T和T+F+H三組間明顯高于Con和T+F組（P＜0.01），T+H組明顯

16、高于其余5組(P＜0.01)。Partially glyco-VMAT2和Native-VMAT2與GAPDH免疫印跡條帶相對吸光度比值，Con、H、T、T+F+H和T+F五組間均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），T+H組明顯高于其余5組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:1.睪酮對H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用部分通過AR實現(xiàn)的。
　　2.睪酮使SH-SY5Y細(xì)胞VMAT2表達(dá)提高部分通過AR實現(xiàn)的。
　　3.氧