華癸中生根瘤菌7653R共生固氮相關(guān)基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、華癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)能夠與紫云英共生形成根瘤，具有嚴格的宿主專一性。本研究利用Tn5-sacB轉(zhuǎn)座子對7653R菌株進行隨機插入突變，從8000個突變子中篩選獲得30個共生缺陷型突變株。使用TAIL-PCR方法克隆了突變株Tn5-sacB側(cè)翼序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個突變株的插入失活基因與百脈根中生根瘤菌(M loti)的未知功能基因有很高的同源性，它們分別為ooa22,1psH,dmtH,gstH

2、和catH。 opa22基因突變株不能形成根瘤，其編碼產(chǎn)物包含257個氨基酸，分子量為28.1 kDa。序列分析表明：Opa22蛋白與不透明蛋白和表面抗原有88.9％的相似性，該類蛋白主要存在于動物和植物病原細菌中，能參與細菌與寄主的相互識別，并刺激感染。根毛卷曲實驗結(jié)果表明：Opa22蛋白可能在共生早期侵染線的形成與根瘤形成階段發(fā)揮作用，其互補菌株HK24能恢復(fù)突變株的結(jié)瘤能力。 lpsH基因突變株形成無效根瘤，其編碼

3、產(chǎn)物包含397個氨基酸，分子量為43.6 kDa。序列與結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明：LpsH蛋白可能含有一個信號肽區(qū)、11個轉(zhuǎn)膜區(qū)和一個定位于周質(zhì)空間的O-抗原聚合酶結(jié)構(gòu)域。其中O-抗原聚合酶為催化合成LPS的必要成分。SDS-PAGE研究結(jié)果表明：突變株LPSI的含量明顯低于野生型菌株。植物盆栽試驗結(jié)果表明：lpsH基因突變株只有很弱的競爭結(jié)瘤能力。電鏡觀測結(jié)果表明：該突變株形成的根瘤含菌細胞含有少量正常的類菌體和大量正在衰亡的細胞碎片。因此，

4、LpsH蛋白是參與LPS合成的膜蛋白，在共生固氮過程中有重要的作用。 dmtH基因突變株也形成無效根瘤，其編碼產(chǎn)物包含249個氨基酸，分子量為27.3 kDa。序列分析結(jié)果表明：DmtH蛋白與去甲基甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶有89.6％的相似性，該酶在甲基萘醌合成的最后一步起去甲基作用。甲基萘醌是類菌體電子傳遞鏈的電子受體。因此，DmtH蛋白參與了類菌體的呼吸作用，在共生固氮過程中也有重要的作用。 gstH基因突變株不能形成根瘤

5、，其編碼產(chǎn)物包含327個氨基酸，分子量為37.3kDa。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明：GstH蛋白具有谷胱苷肽硫基轉(zhuǎn)移酶(Gst)家族的功能域，Gst能催化還原態(tài)的谷胱苷肽(GSH)通過巰基連接到多種特異性底物。有研究結(jié)果表明：GSH參與根瘤菌的抗氧化防御反應(yīng)，在共生固氮過程中有重要的作用。gstH基因能互補突變株的共生能力。 catH基因突變株形成無效根瘤，其編碼產(chǎn)物包含391個氨基酸，分子量為42.2kDa。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明

6、：CatH蛋白具有CoA轉(zhuǎn)移酶家族Ⅲ的功能域。雖然有研究表明：CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA可能與根瘤菌的共生有關(guān)，但是catH基因是如何影響共生固氮作用仍未查明。植物盆栽試驗結(jié)果表明：catH基因突變株只能形成少量的假瘤，其競爭結(jié)瘤能力也明顯降低。catH基因的雙交換重組缺陷菌株HK33也有相同的Nod<'->共生表型，進一步證實了catH基因的共生功能。 上述研究結(jié)果和結(jié)論，對研究華癸中生根瘤菌與紫云英的共生固氮機理有非常重要的理論意