胰腺癌相關(guān)基因突變檢測及RASA1異常表達意義的研究.pdf

1、背景:
　　 胰腺癌是目前已知的惡性度最高的腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年增高。由于該病起病隱匿，病程進展迅速，早期診斷困難，其總體死亡率高，平均生存期為診斷后6個月，5年生存率僅為5％?；趥鹘y(tǒng)治療在胰腺癌中作用有限，為了改善療效，降低藥物毒性，靶向治療藥物為胰腺癌的治療開辟了新的途徑。其中靶向EGFR的治療已顯示出初步療效，但仍對部分患者無效。
　　 EGFR受體信號通路在細胞增殖和分化的過程中起著重要作用，其信號分

2、子基因的突變在腫瘤發(fā)展過程中具有重要作用。EGFR，KRAS，BRAF是該信號通路中的關(guān)鍵分子，其基因突變與該信號通路的激活及腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切。
　　 RASGAPs則通過增加RAS蛋白內(nèi)在的GTPase活性，水解RASGTP形成RASGDP，關(guān)閉RAS信號通路，實施負調(diào)控作用。RASA1作為RASGAPs中的一種，是RAS信號通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。它的表達缺失或下調(diào)也引起RAS信號通路的活化，但在胰腺癌中的作用及意義至今未見研究

3、報道。
　　 目的:
　　 通過檢測胰腺癌中EGFR/KRAS信號通路中EGFR、KRAS、BRAF分子突變狀況，及RASA1在胰腺癌細胞和組織中的表達，探討它們在胰腺癌發(fā)病中可能的作用及其臨床意義。為進一步闡明胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制，以尋找胰腺癌診斷與治療新靶點提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、收集2000年至2009年廣東省人民醫(yī)院手術(shù)切除組織石蠟標本胰腺癌32例，經(jīng)經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生

4、復(fù)習(xí)閱片后重新構(gòu)建組織切片。所有患者術(shù)前均未進行放療、化療及其它抗腫瘤治療，臨床病理資料完整。另取胰腺囊腫5例，慢性胰腺炎5例組織標本作為對照。
　　 2、石蠟切片常規(guī)脫蠟/再水化，收集組織，用Qiagen公司QIAampDNAFFPETissuekit提取基因組DNA:按說明書提示提取DNA。使用TaKaRa公司PremixExTaqTMHotStartVersion擴增EGFR18、19、21外顯子片段，KRAS2、3外顯子

5、片段，BRAF15外顯子片段:95℃5min—(95℃45s—58℃45s—72℃1min)×35個循環(huán)—72℃5min，12℃保溫。采用優(yōu)晶公司生產(chǎn)的凝膠回收試劑盒Ⅱ進行PCR產(chǎn)物的純化:收集瓊脂糖凝膠電泳目的條帶，溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至Mu-PuDNA回收純化柱上，離心棄濾液，SPW洗滌緩沖液洗滌柱子，洗脫DNA。以純化后的PCR產(chǎn)物作為模板，使用美國ABI公司的BigDyeTerminatorv3.1試劑盒進行測序PCR反應(yīng)。96℃變

6、性1min—(96℃變性10s—55℃褪火5s—60℃延伸4min)×25個循環(huán)—4℃保溫，產(chǎn)物漂洗預(yù)變性后轉(zhuǎn)移到96孔板，ABI公司生產(chǎn)的3100基因分析儀進行測序。
　　 3、采用Trizol(LifeTechnologies公司)提取細胞總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，進行熒光定量PCR。在ABI-7500型熒光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:95℃10min—(95℃30s—58℃30s—7

7、2℃30s)×50個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認RealTimePCR的擴增曲線和融解曲線，利用實時熒光PCR儀自帶軟件進行分析，獲得產(chǎn)物Ct值;并回收產(chǎn)物，進行瓊脂糖凝膠電泳。RASA1mRNA的相對表達量采用2-ΔCt計算。
　　 4、以400μl100℃1×SDS裂解液裂解2×106個細胞，煮沸10min;4℃、20，000×g離心10min，取上清;BCA法測定蛋白濃度;調(diào)整濃度至1μg/μl，取20μl蛋白行SDS—PAGE電

8、泳;將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上;兔抗人RASA1多克隆抗體(Epitomics公司)1:1000稀釋、兔抗人GAPDH單克隆抗體(CST公司)1:2000稀釋，4℃孵育過夜;加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(CST公司)1:1500稀釋，室溫孵育1小時;ECL(Invitrogen公司)顯色，曝光。BandScan5.0軟件分析條帶灰度進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 5、采用免疫組化EnVision染色法檢測RASA1蛋白表達。石蠟

9、組織常規(guī)脫蠟水化;pH8.0Tris-EDTA液高溫高壓修復(fù);3％H2O2室溫孵育15min消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗;兔抗人RASA1單克隆抗體(Lifespan公司)1:50稀釋，室溫孵育60min，PBS漂洗;羊抗兔EnVision試劑(上海基因公司)室溫孵育35min，PBS漂洗;DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照，用已知表達陽性的人卵巢癌標本作為陽性對照。陽性細胞必須具備:①細胞結(jié)構(gòu)清

10、晰;②陽性顆粒定位準確;③著色明顯高于背景，對比清楚。RASA1定位于細胞質(zhì)。陽性染色為黃色，棕黃色或棕褐色。免疫組化結(jié)果根據(jù)陽性細胞染色強度判定:無著色為0分，淡黃色或黃色為1分，棕黃色或棕褐色為2分。
　　 6、采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。對正態(tài)分布的連續(xù)性變量采用((x)±s)描述，非正態(tài)分布的連續(xù)性數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)描述。采用四格表x2檢驗及Fisher精確概率法x2檢驗比較胰腺癌組織與胰腺良性病變組織

11、中KRAS突變率差異。采用One-wayANOVA分析比較胰腺癌細胞株及正常胰腺細胞株中RASA1mRNA表達水平差異，采用SNK法比較組間差異;采用四格表x2檢驗比較RASA1蛋白在胰腺癌組織中表達水平與其各臨床病理因素之間的關(guān)系，以及RASA1蛋白在胰腺癌組織及胰腺良性病變組織中的表達差異，采用兩獨立樣本t檢驗比較胰腺癌患者中RASA1表達水平與年齡的關(guān)系。不滿足正態(tài)分布的的數(shù)據(jù)采用兩樣本比較秩和檢驗(Wilcoxon兩樣本比較法)

12、。P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、胰腺組織中EGFR、KRAS、BRAF突變率
　　 所檢測胰腺癌臨床組織標本中未見BRAF突變。32例胰腺癌患者中有24例患者KRAS基因存在突變，突變率為75％。而胰腺良性病變中KRAS突變率為0，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。24例KRAS突變中包括22例12密碼子突變(91.7％)，其中14例GGT突變?yōu)镚AT(G-D)，8例突變?yōu)镚TT(G

13、--V);2例61密碼子突變(8.3％)，CAA突變?yōu)镃TA(Q--L)。13密碼子未見突變。
　　 32例胰腺癌患者中3例存在EGFR突變(突變率為9.4％)，其中包括1例19密碼子突變，2例21密碼子突變，10例良性病變組織未發(fā)現(xiàn)EGFR突變。
　　 2、胰腺細胞中RASA1mRNA和蛋白表達水平
　　 各胰腺癌細胞株中RASA1的mRNA和蛋白表達水平均低于正常的胰腺導(dǎo)管細胞(P＜0.05)。KRAS野生型

14、胰腺癌細胞中RASA1的mRNA和蛋白表達水平均低于KRAS突變型胰腺癌細胞(P＜0.05)。
　　 3、胰腺組織中RASA1表達水平及其與臨床病理特征的關(guān)系
　　 在組織中，胰腺癌中RASA1蛋白表達水平顯著低于良性病變組織(P＜0.05);侵犯周邊器官的腫瘤組織中RASA1表達顯著低于局限于胰腺內(nèi)的組織(P＜0.05);Ⅰ期胰腺癌組織RASA1的表達則顯著高于Ⅱ、Ⅲ期的癌組織(P＜0.05);但RASA1表達與胰腺癌