HPV-E6E7基因轉染人樹突狀細胞抗食管癌體內外研究.pdf

1、目的:本研究旨在分離人臍帶血來源的CD34+干細胞并在體外分化擴增為成熟的功能性樹突狀細胞(dendritic cell,DC)的過程,并以HPV16E6/18E7基因轉染 DC制備DC疫苗,檢測其生物學特性;觀察并測定其在體外誘導的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)活性,同時觀察其對經(jīng)免疫重建的SCID小鼠體內食管癌生長的免疫防治效應。
　　方法:1.應用質粒提取試劑盒提取 pcDN

2、A3.1-HPV16E6/18E7質粒,分光光度計檢測其濃度和純度,然后通過陽離子脂質體 DMRIE-C將質粒DNA轉入經(jīng)rhGM-CSF、rhTNF-α體外聯(lián)合誘導12天的人臍血來源CD34+干細胞,制備負載 HPV16E6/18E7基因的DC疫苗,倒置顯微鏡下觀察并以流式細胞儀檢測轉染前、后其表面分子CD80、CD86、CD83及轉染后E6/E7蛋白的表達情況。
　　2.斑點雜交法測定食管癌細胞EC-109的HPV類型。3.體

3、外抗腫瘤實驗采用MTT法,檢測HPV18E7-DC疫苗誘導的人外周血CTL對食管癌細胞EC-109的殺傷活性。4.HPV16E6/18E7-DC疫苗小鼠腹腔內注射2次,間隔3d,70d后檢測疫苗是否具有致瘤性。5.按隨機數(shù)字法將SCID小鼠隨機分為免疫保護組和免疫治療組。免疫保護組隨機分成C、Im-T、Im-16D和Im-18D四小組,分別用PBS、T細胞、HPV16E6-DC+T細胞、HPV18E7-DC+T細胞免疫接種后,再接種EC

4、-109細胞;免疫治療組分成 C、Tr-T、Tr-16D和Tr-18D四小組,分別以 PBS、T細胞、HPV16E6-DC+T細胞和HPV18E7-DC+T細胞對EC-109荷瘤小鼠進行免疫治療。以誘發(fā)小鼠腫瘤的潛伏期和腫瘤的體積、重量、生長速度等為觀察指標,并進行統(tǒng)計學分析,以探討 HPV16E6/18E7-DC疫苗對食管癌細胞株EC-109體內生長的免疫保護和免疫治療效應。
　　結果:1.50ml臍帶血可分離出 CD34+干細

5、胞約1.0×106,臺盼藍染色95％以上不顯色;在rhGM-CSF和rhTNF-α聯(lián)合誘導下,14天后CD34+干細胞約擴增10-20倍,DC的純度達90%以上。CD34+干細胞在培養(yǎng)過程中逐漸形成細胞集落,集落逐日增多增大,并在第8-9天達到最大,此后集落逐漸減少變小,并脫落成具有典型樹枝狀突起的成熟DC。表面分子CD80、CD86、CD83表達陽性率分別為65.5%、65.9%和80.7%。HPV16E6/18E7基因轉染后 DC生

6、長良好,流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)表面分子CD80、CD86、CD83表達陽性率分別為81.6%、80.5%和86.6%,目的基因蛋白E6、E7表達率分別為38.6%和47.5%。2.斑點雜交法檢測發(fā)現(xiàn)食管癌細胞EC-109的病毒類型為HPV18型。3. HPV18E7-DC疫苗致敏的外周血CTL對食管癌細胞EC-109的殺傷活性明顯高于DC組致敏的CTL及T組和C組(P<0.01),且隨效靶比的增高而增強(P<0.05)。DC致敏的CTL的殺

7、傷活性與T組比較也有顯著性差異(P<0.05)。
　　4.致瘤性研究顯示腹腔注射HPV16E6/18E7-DC疫苗的小鼠均未發(fā)生腫瘤。5.在免疫保護組,Im-16D和Im-18D組腫瘤的生長速度減慢,腫瘤潛伏期較C組和Im-T組明顯延長(P<0.01),腫瘤體積和腫瘤重量均明顯小于C組和Im-T組(P<0.01),Im-16D和Im-18D組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在免疫治療組,Tr-16D和Tr-18D腫瘤體積和腫

8、瘤重量均明顯小于C組和Tr-T組(P<0.01),Tr-16D和Tr-18D比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論:1.以免疫磁珠法從人臍帶血中分離CD34+干細胞,在體外經(jīng)rhGM-CSF和rhTNF-α聯(lián)合誘導14天,可分化擴增出大量高純度、形態(tài)功能成熟的DC,此方法操作簡便,分離細胞量大、純度高,具有巨大的實用價值。2.使用陽離子脂質體將 HPV-E6E7基因轉入 DC,細胞生長良好,并且目的基因在DC內高表達,說

9、明DC疫苗構建成功,陽離子脂質體可以安全、有效的介導基因轉入DC,為DC疫苗的構建做了有益探索。3. HPV18E7-DC疫苗在體外能誘導出高效的特異性CTL,對表達HPV18的食管癌EC-109細胞產(chǎn)生強大的特異性殺傷效應。4.HPV16E6/18E7-DC疫苗無體內致瘤性,安全可靠。5. HPV16 E6/18E7-DC疫苗能顯著抵抗EC-109細胞對小鼠的攻擊,并能顯著抑制荷瘤小鼠體內腫瘤的生長,具有高效而顯著的免疫保護和免疫治療