小尾寒羊TNNI2和TNNI3基因的克隆、結(jié)構(gòu)分析及組織表達(dá)分析.pdf

1、肌鈣蛋白I（Troponin I，TnI）不僅對肌肉的正常收縮行使功能至關(guān)重要，還能從多個(gè)方面影響到肌肉的品質(zhì)。肌鈣蛋白I家族三個(gè)成員分別為肌鈣蛋白I1（TNNI1）、肌鈣蛋白I2（TNNI2）和肌鈣蛋白I3（TNNI3）。本試驗(yàn)根據(jù)小尾寒羊和杜泊羊轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選到差異表達(dá)基因TNNI2和TNNI3。通過比對得到的相關(guān)基因保守序列，利用RT-PCR、3’RACE和5’RACE等技術(shù)方法克隆得到兩個(gè)基因的cDNA全長；對兩個(gè)基因的核

2、苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行了多種生物信息學(xué)比對分析；運(yùn)用qRT-PCR在mRNA水平驗(yàn)證了兩個(gè)基因在小尾寒羊和杜泊羊不同組織中的表達(dá)豐度。研究結(jié)果如下：
　　（1）采用RACE等方法，以小尾寒羊股二頭肌為試驗(yàn)材料，克隆得到TNNI2基因cDNA全長714bp，開放閱讀框?yàn)?49bp，編碼182個(gè)氨基酸，3’端有88bp的非翻譯區(qū)（不包括polyA尾），5’端有77bp的非翻譯區(qū)。以小尾寒羊心肌提取mRNA為模板，克隆得到TNNI3基

3、因cDNA全長847bp（不包括polyA尾），開放閱讀框?yàn)?39bp，編碼212個(gè)氨基酸，3’端有65bp的非翻譯區(qū)，5’端有143bp的非翻譯區(qū)。提交GenBank,獲得登錄號分別為KX110054和KX110055。
　　（2）使用多種軟件和在線數(shù)據(jù)庫分析，綿羊TNNI2蛋白和山羊同源性最高，分子量為21.4kDa，等電點(diǎn)為8.8，是一種親水性較好的堿性蛋白；二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，占到了70％以上，兼有少量的無規(guī)則卷曲；該

4、蛋白是一種細(xì)胞內(nèi)功能蛋白，并沒有預(yù)測到信號肽位點(diǎn)；擁有1個(gè)O端糖基化位點(diǎn)和9個(gè)磷酸化位點(diǎn)。綿羊的TNNI3蛋白則與牛的該蛋白具有極高同源性，分子量為24.1kDa，等電點(diǎn)為9.8，也是一種親水性較好的堿性蛋白；其二級結(jié)構(gòu)與TNNI2具有較高的相似性，α-螺旋的比例為70.75%，其次是不規(guī)則卷曲；該蛋白未預(yù)測到信號肽位點(diǎn)；預(yù)測該蛋白具有多達(dá)14個(gè)磷酸化位點(diǎn)，但是沒有任何糖基化位點(diǎn)。
　?。?）小尾寒羊和杜泊羊不同組織中，兩個(gè)基因在

5、mRNA水平存在較大的表達(dá)差異。TNNI2基因的mRNA在肋間肌、背最長肌和股二頭肌中高表達(dá)，在肺臟、胃、心臟和肝臟等組織中表達(dá)量很低，說明了TNNI2基因在表達(dá)上具有特異性。在不同的品種之間，TNNI2基因在杜泊羊肋間肌組織中的表達(dá)量極顯著高于小尾寒羊（P＜0.01）；在杜泊羊股二頭肌和肺臟組織中表達(dá)量顯著高于小尾寒羊（P＜0.05）；但是在背最長肌、肝臟、胃和心臟組織中的表達(dá)量差異不顯著。
　　TNNI3基因在綿羊的心臟組織中

6、高表達(dá)，而在股二頭肌、肝臟、肺和胃中少量表達(dá)甚至不表達(dá)，說明了TNNI3基因的表達(dá)在生物體組織中有一定的空間特異性。TNNI3基因在綿羊心臟中的表達(dá)量極顯著高于其他組織（P＜0.01），說明TNNI3基因具有心臟表達(dá)特異性。在不同的品種間，TNNI3基因在杜泊羊心臟組織中的表達(dá)量極顯著高于小尾寒羊（P＜0.01），而在股二頭肌、肝臟、肺和胃中兩個(gè)品種羊的表達(dá)差異不顯著。
　?。?）TNNI2蛋白在小尾寒羊和杜泊羊背最長肌、血管、肋