新工藝通心絡(luò)對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，是人類(lèi)致殘和死亡的重要原因之一，其中以缺血性腦血管病最為多見(jiàn)。目前溶栓治療和神經(jīng)保護(hù)治療是缺血性腦血管病的兩大干預(yù)策略。溶栓治療受到嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，同時(shí)可帶來(lái)腦出血的副作用。神經(jīng)保護(hù)研究雖越來(lái)越受到重視，但迄今仍沒(méi)有公認(rèn)的具有顯著臨床療效的神經(jīng)保護(hù)劑。通心絡(luò)膠囊是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制而成的中藥復(fù)方制劑。大量基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)，通心絡(luò)膠囊可以從多個(gè)病理環(huán)節(jié)減輕腦缺血性損傷。新工藝通心絡(luò)(nTXL)在原

2、有組方基礎(chǔ)上，采用蟲(chóng)藥提取工藝對(duì)原有制劑進(jìn)行了改良，本研究在考察其對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)作用基礎(chǔ)上，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 目的：采用三氯化鐵局灶性腦缺血模型、線栓法大腦中動(dòng)脈梗塞模型、動(dòng)靜脈旁路血栓模型以及正常大鼠血小板聚集實(shí)驗(yàn)，觀察新工藝通心絡(luò)(nTXL)對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠腦梗塞面積、腦含水量、缺血區(qū)VEGF/BDNF表達(dá)的影響及抗血栓和抑制血小板聚集作用，探討該制劑對(duì)缺血后腦組織的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制，為其開(kāi)發(fā)與應(yīng)

3、用提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。 方法： 本研究分為以下三個(gè)部分： 1．新工藝通心絡(luò)對(duì)三氯化鐵致大鼠局灶性腦缺血后腦組織損傷的保護(hù)作用：清潔級(jí)健康Wistar大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為五組：假手術(shù)組、模型組、新工藝通心絡(luò)高劑量(2.24g/kg·d)、低劑量(1.12g/kg·d)、尼莫地平組。灌胃10天后，制備三氯化鐵局灶性腦缺血模型，造模后24小時(shí)，處死動(dòng)物取腦。用TTC染色法測(cè)定梗塞面積，用干濕重法測(cè)定腦含水量，HE染

4、色觀察神經(jīng)細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)改變。 2．新工藝通心絡(luò)對(duì)線栓法致局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)VEGF、BDNF表達(dá)的影響： 雄性清潔級(jí)健康SD大鼠，隨機(jī)分為五組：假手術(shù)組、模型組、新工藝通心絡(luò)高劑量(2.24g/kg·d)、低劑量(1.12g/kg·d)、尼莫地平組。采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈梗塞(MCAO)局灶性腦缺血模型。以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法及免疫組化法分別檢測(cè)腦缺血后3h、24h、72h、7d缺血區(qū)VEG

5、F、BDNF mRNA和蛋白表達(dá)的變化。 3．新工藝通心絡(luò)對(duì)實(shí)驗(yàn)性血栓形成及血小板聚集的影響： 清潔級(jí)健康Wistar大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為以下五組：模型組、新工藝通心絡(luò)高劑量(2.24g/kgod)、中劑量(1.12g/kg·d)、低劑量(0.56g/kg.d)、阿斯匹林組。給藥十天后，采用動(dòng)靜脈旁路血栓形成模型觀察新工藝通心絡(luò)對(duì)實(shí)驗(yàn)性血栓的影響；采用比濁法，以ADP、膠原作為誘導(dǎo)劑考察了新工藝通心絡(luò)對(duì)大鼠血小板聚集

6、的影響。 結(jié)果： 第一部分： 對(duì)三氯化鐵所致大鼠局灶性腦缺血腦梗塞面積的影響：模型組梗塞區(qū)占半腦、全腦的重量百分比分別為：9.20±3.55％、4.61±1.78％：新工藝通心絡(luò)低劑量組梗塞區(qū)占半腦、全腦的重量百分比分別為：6.14±2.18％、3.08±1.08％(P<0.05)；新工藝通心絡(luò)高劑量組梗塞區(qū)占半腦、全腦的重量百分比分別為：5.14±2.75％、2.59±1.37％(P<0.01)。結(jié)果顯示：新工

7、藝通心絡(luò)能夠顯著抑制局灶性腦缺血的梗塞面積。 對(duì)三氯化鐵所致大鼠局灶性腦缺血腦含水量的影響：與假手術(shù)組相比，模型組患側(cè)半球含水量明顯增加(80.85±0.45vs 79.72±0.41，P<0.01)。與模型組相比，nTXL高劑量組能夠顯著抑制腦含水量(80.09±0.97 vs 80.85±0.45，P<0.05)，結(jié)果顯示：新工藝通心絡(luò)對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦水腫有顯著抑制作用。 對(duì)三氯化鐵所致局灶性腦缺血大鼠組織形態(tài)學(xué)

8、的影響： 模型組大鼠缺血區(qū)皮層細(xì)胞周?chē)g隙增寬，血管周?chē)窠?jīng)細(xì)胞大小不一，毛細(xì)血管萎縮，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，排列紊亂，分布不均，細(xì)胞核深染固縮，部分胞質(zhì)自溶，部分顆粒脫失，周邊出現(xiàn)較大空暈，大鼠腦組織形態(tài)改變嚴(yán)重。新工藝通心絡(luò)高、低劑量治療組大鼠能夠使上述缺血性損傷明顯減輕，其中以高劑量組為優(yōu)。 第二部分： 對(duì)線栓法所致局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)BDNF mRNA的影響： BDNF時(shí)程變化：本實(shí)驗(yàn)中，大腦局灶性腦缺

9、血后3h表達(dá)略有上升，而24h表達(dá)下降，3d后又開(kāi)始上升，至缺血后7天達(dá)峰。新工藝通心絡(luò)對(duì)BDNF mRNA水平的影響：新工藝通心絡(luò)高劑量組在缺血后3h、24h、7d BDNF mRNA的表達(dá)水平均顯著高于模型組(P<0.01，P<0.05)，缺血后3d與模型組相比雖有一定的升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低劑組在缺血后3h、24h BDNF mRNA的表達(dá)與模型組相比，有明顯升高(P<0.01，P<0.05)。 對(duì)線栓法所致的局灶性

10、腦缺血大鼠缺血區(qū)VEGF mRNA的影響： VEGF時(shí)程變化：在正常腦組織中VEGF mRNA表達(dá)很少，缺血后3h、24h、3d，VEGF mRNA表達(dá)逐漸增加，3d達(dá)高峰，缺血7d后又降至約正常水平。 新工藝通心絡(luò)對(duì)VEGF mRNA水平的影響：與模型組相比，新工藝通心絡(luò)高劑組(2.24g/kg)在缺血后3h、24hVEGFmRNA的表達(dá)水平均高于腦缺血模型組，但由于組內(nèi)差異較大，未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在缺血后3d、7d，新

11、工藝通心絡(luò)高劑組VEGF mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01，P<0.05)?？梢?jiàn)高劑組能延長(zhǎng)VEGF mRNA的表達(dá)時(shí)相，在缺血后第七天仍有大量表達(dá)。新工藝通心絡(luò)低劑量組(1.12g/kg)與模型組相比，無(wú)明顯差異。 對(duì)線栓法所致的局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)VEGF、BDNF蛋白的影響： 免疫組化染色顯示：在腦組織缺血區(qū)，BDNF主要在神經(jīng)元陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)趨勢(shì)與mRNA基本吻合：缺血后3h表達(dá)略有上升，而24h表達(dá)下降，3

12、d后又開(kāi)始上升，至缺血后7天達(dá)峰。在缺血后各時(shí)間點(diǎn)，新工藝通心絡(luò)高、低劑量組BDNF的表達(dá)均強(qiáng)于模型組，其中以高劑量組為優(yōu)。免疫組化染色顯示：VEGF在腦組織缺血區(qū)神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均有陽(yáng)性表達(dá)。在缺血后3h～3d間，VEGF表達(dá)逐漸加強(qiáng)，缺血后7天表達(dá)變?nèi)?。在缺血后各時(shí)間點(diǎn)，新工藝通心絡(luò)高、低劑量組VEGF的表達(dá)均強(qiáng)于模型組，其中以高劑量組為優(yōu)。 第三部分： 對(duì)實(shí)驗(yàn)性血栓形成的影響： 對(duì)照組血栓

13、的濕重和干重分別為59.81±17.84和10.32±3.08；新工藝通心絡(luò)中劑量組(1.12g/kg)的血栓的濕重和干重分別為31.28±9.56和5.84±2.00(P<0.01)，抑制率達(dá)47.7％和43.4％；低劑量組(0.56g/kg)組的血栓的濕重和干重分別為43.21±5.79(P<0.05)和7.73±1.76(P<0.05)，抑制率達(dá)27.8％和24.5％；高劑量組(2.24g/kg)的血栓濕重和干重分別為54.73±

14、14.96和10.15±3.13，與模型組相比無(wú)顯著性差異。 對(duì)血小板聚集的影響：新工藝通心絡(luò)2.24g/kg、1.12g/kg、0.56g/kg對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率分別為：27.9％、42.8％、38.8％；對(duì)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率分別為：20.8％、28.0％、26.0％。除高劑組對(duì)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)外，其它組與正常組血小板最大聚集率相比，均有顯著性降低作用(p<0.01或p<0.05)。 結(jié)