磁共振成像兼容的鈮鉭合金生物相容性研究.pdf

1、目的：
　　自從19世紀80年代磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)應(yīng)用于臨床以來，發(fā)展十分迅速，目前已成為當今醫(yī)學(xué)診斷中最強有力的工具之一。由于MRI檢查時需要將人體置于強大的外加磁場中，當帶有金屬移植物的病人進行MRI檢查時，磁場與金屬物質(zhì)之間的相互作用可能會對病人或金屬裝置的功能造成損害。另一方面，靜磁場的均勻性和梯度磁場的線性受到金屬物質(zhì)的破壞和干擾造成的影像變形所形成的磁敏感性偽影(

2、magnetic susceptibility artifact，MSA)，有可能影響對疾病的診斷。目前臨床上常用的合金為不銹鋼、鈷基合金、鈦及鈦合金。不銹鋼和鈷基合金由于含有鐵磁性元素鈷和鎳導(dǎo)致其磁化率較高，磁敏感性偽影較大;鈦及鈦合金的抗拉強度、剛性、延長率相對不足限制了它們在介入領(lǐng)域的使用。Nb-60Ta-2Zr是中科院金屬研究所自主研發(fā)的一種新型的磁共振成像兼容的醫(yī)用合金。Nb-60Ta-2Zr合金中主要的構(gòu)成元素為鈮、鉭和鋯，

3、三者均為無毒性金屬元素，保證了鈮鉭合金的生物安全性。三者均為順磁性金屬元素，因而鈮鉭合金的體積磁化率(214×10-6)與Ti較為接近(182×10-6)，遠低于不銹鋼和鈷基合金，約106數(shù)量級。這一特性使得Nb-60Ta-2Zr在磁共振成像中極為兼容。從目前的實驗結(jié)果來看，鈮鉭合金的楊氏模量為142GPa，低于316LSS(200GPa)和鈷鉻合金(210-240GPa)，與CP鈦(110GPa)較為接近，這一特性使鈮鉭合金應(yīng)用于骨科

4、領(lǐng)域成為可能;鈮鉭合金的耐腐蝕性與Ti接近(排氣后的0.17MNaCl下的擊穿電位為9V)，明顯高于316LSS(0.4-0.48V)和鈷鉻合金(0.87V)，這一特點使鈮鉭合金和鈦同樣適合用于人體生理環(huán)境;鈮鉭合金的屈服強度和抗拉強度分別為330MPa和470MPa，與316LSS(170-1100MPa和480-1350MPa)和鈷鉻合金(300-1500MPa和800-1800MPa)接近，但高于CP鈦(280MPa和345MPa

5、)，這使得鈮鉭合金具備良好的可加工性能;鈮鉭合金的密度(12.03g/cm3)相對于不銹鋼(316LSS，7.93g/cm3)、鈷基合金(L605，9.13g/cm3)和鈦(4.5g/cm3)最高，因而鈮鉭合金的X線成像最為清晰。因此，鈮鉭合金作為一種新型醫(yī)用合金極具應(yīng)用前景，其生物相容性亟待研究。將Nb，Ta作為對照研究，為醫(yī)用合金成分的選擇提供實驗依據(jù)。
　　實驗方法：
　　1、材料制備
　　Nb-60Ta-2Zr

6、，Ta，Nb，316LSS和L605合金5組樣品經(jīng)線切割成10mm×10mm×2mm，400＃-2000＃砂紙打磨，拋光至1μm。丙酮、無水酒精、75％酒精、超純水依次清洗10min，干燥備用。
　　2、實驗材料分組
　　(1)論文一:實驗組:Nb-60Ta-2Zr;對照組:Ta，Nb，316LSS和L605合金。
　　(2)論文二:實驗組:Nb-60Ta-2Zr;對照組:Ta，Nb，316LSS和L605合金。

7、>　　(3)論文三:實驗組:Nb-60Ta-2Zr;對照組:316LSS。
　　3、白蛋白和纖維蛋白原在Nb-60Ta-2Zr表面的吸附
　　(1)表面粗糙度
　　將制備好的樣品置于激光共聚焦顯微鏡LEXT OLS4000(Olympus，USA)下，調(diào)整儀器參數(shù)，儀器取樣長度l=0.8mm，每次測量包括5段取樣長度，每次測量長度為4mm，重復(fù)3次。
　　(2)白蛋白和纖維蛋白原的吸附
　　纖維蛋白原和白蛋

8、白的磷酸鹽緩沖液(PH=7.4)稀釋至0.3mg/ml和3mg/ml。將樣品置于24孔板內(nèi)，6個/組×5組×3次，加蛋白溶液，37℃靜置孵育1h，蒸餾水清洗未粘附的蛋白，然后加5％SDS200μl，37℃過夜，超聲10min，BCA試劑盒(Pierce Biotechnology，USA，＃23235)檢測SDS蛋白溶液。
　　(3)X射線光電子能譜(XPS)分析
　　Nb-60Ta-2Zr樣品在37℃下與全血孵育1h，依次

9、用PBS與蒸餾水沖洗，干燥，XPS分析樣品表面化學(xué)成分。采用ESCALAB250表面分析系統(tǒng)(Thermo VG，USA)，1486.6eV單色源Al靶X-射線源，90°離去角檢測，束斑大小500μm×500μm，掃描能量50eV，能量梯度0.1eV。C1s的結(jié)合能為284.8eV。按照Shirley法去除背景。通過XPSPEAK4.1分析軟件，進行XPS譜的曲線擬合以確定峰位、高度、寬度和高斯/洛倫茲比。
　　4、血液相容性

10、r>　　(1)血小板的粘附和活化
　?、傺“逭掣皆囼?采健康新鮮人血（血常規(guī)、凝血四項在正常范圍，10天內(nèi)未服用抗凝劑），檸檬酸鈉1∶9抗凝，75g×5min離心制得富血小板血漿，調(diào)整血小板密度至3.0×1011/l。樣本置于24孔板內(nèi)，3個/組×5組，與100μlPRP37℃孵育2h，PBS沖洗，2.5％戊二醛室溫固定12h，梯度脫水，干燥，噴金，SEM觀察。每種樣本隨機選取15個區(qū)域，用計算機輔助分析圖像軟件計算每種金屬表面

11、血小板覆蓋的面積。
　?、谡掣窖“迦樗崦摎涿富钚?樣本置于24孔板內(nèi)，6個/組×5組×3次，與100μlPRP37℃靜置孵育60min，PBS沖洗，100μl1％Triton-PBS透膜。60min后，Triton-PBS洗液上LDH試劑盒檢測。
　　③血小板活化檢測:將樣本置于24孔板內(nèi)，6個/組×5組×3次，加1ml全血（EDTA抗凝），37℃靜置孵育1h，血樣離心，ELISA試劑盒檢測血清中P-選擇素含量。
　

12、　(2)凝血
　　將樣本置于24孔板內(nèi)，6個/組×5組×3次，采健康新鮮人血（血常規(guī)、凝血四項在正常范圍，10天內(nèi)未服用抗凝劑），檸檬酸鈉1∶9抗凝，將樣本與血清37℃靜置孵育1h。全自動血凝分析儀檢測PT、APTT、TT。
　　(3)溶血
　　采健康新鮮人血（血常規(guī)、凝血四項在正常范圍，10天內(nèi)未服用抗凝劑），檸檬酸鈉1∶9抗凝，與生理鹽水4∶5稀釋。調(diào)整生理鹽水用量，使稀釋后的抗凝人血0.2ml在10ml蒸餾水中于

13、545nm處的吸光度值為0.8±0.3。生理鹽水陰性對照，蒸餾水陽性對照，實驗組3個/組×5組×3次。各實驗組按3cm2/ml加稀釋血樣，37℃恒溫水浴3h。750g離心5min，分光光度計545nm檢測吸光度值，帶入公式計算溶血率:Hemolysis=OD(test)-OD(negative control)/OD(positivs control)-OD(negative control)×100
　　5、人臍靜脈內(nèi)皮細胞在N

14、b-60Ta-2Zr表面的粘附與增殖
　　(1)細胞培養(yǎng)
　　復(fù)蘇后的HUVEC加入培養(yǎng)基;在37℃，5％CO2及飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，隔天換液，細胞長至80％融合時，進行傳代。
　　(2)材料表面細胞粘附的形態(tài)學(xué)觀察
　　取1塊無菌24孔板，將Nb-60Ta-2Zr和316LSS放入孔中，傳代后的HUVEC細胞經(jīng)0.25％胰酶消化，吹打成細胞懸液，計數(shù)板下計數(shù)，以2×104/ml

15、的密度接種于金屬樣品表面，每種金屬每個時間點接種3片，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于接種后6h取出，PBS沖洗，戊二醛固定12h，梯度乙醇脫水，噴金，掃描電鏡下觀察細胞形態(tài)。
　　(3)材料表面粘附細胞的VE-cadherin表達
　　將HUVEC分別接種在Nb-60Ta-2Zr和316LSS上3d后，用細胞刮小心的將樣品表面的細胞刮下，裂解，離心。收集上清。Western blot檢測VE-cadherin在兩種樣品表面的表達。

16、
　　(4)材料表面細胞增殖實驗
　　細胞及接種方法同5(2)，樣品分別于接種后6h、1d、2d和3d取出;移入新的24孔板中，每孔加入培養(yǎng)液和CCK-8混合液，孵育3h后，避光條件下每孔取出溶液放入新的96孔板中，450nm波長條件下酶標儀檢測OD值。
　　6、統(tǒng)計學(xué)分析
　　3(2)，4(1)①，4(1)②，4(1)③，4(2)，4(3)，5(3)，5(4)的結(jié)果用(x)±SD表示。使用SPSS14.0軟件進

17、行單因素方差(One way ANOVA)分析，之后，組間的多重比較采用SNK法。所有的檢測數(shù)據(jù)，重復(fù)3次，p＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實驗結(jié)果：
　　1、白蛋白和纖維蛋白原在Nb-60Ta-2Zr表面的吸附
　　(1)表面粗糙度
　　5種金屬表面粗糙度（Ra）:Nb-60Ta-2Zr合金為132±5nm，Nb為162±2nm，Ta為136±1nm，316LSS為31±2nm，L605鈷鉻合金為35±1

18、nm。
　　(2)白蛋白和纖維蛋白原的吸附
　　各實驗組的白蛋白吸附量(μg/cm2):Nb-60Ta-2Zr合金為2.07±0.28，Nb為1.95±0.25，Ta為2.05±0.18，316LSS為2.3±0.24;L605鈷鉻合金為2.49±0.25。其中316LSS與其他各實驗組比較，白蛋白吸附量無差異(p＞0.05);L605鈷鉻合金的白蛋白吸附量高于Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta(p＜0.05);Nb-6

19、0Ta-2Zr合金、Nb和Ta之間無差異（p＞0.05）。
　　各實驗組的纖維蛋白原吸附量(μg/cm2):Nb-60Ta-2Zr合金為2.66±0.41，Nb為2.69±0.32，Ta為2.58±0.2，316LSS為3.16±0.18;L605鈷鉻合金為3.49±0.2。Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之間無差異(p＞0.05);316LSS與L605鈷鉻合金的纖維蛋白原吸附量無差異(p＞0.05);316LSS和L60

20、5鈷鉻合金的吸附量明顯高于Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta(p＜0.05)。
　　各實驗組吸附的蛋白比(BSA/BSF)為:Ta(0.79)＞Nb-60Ta-2Zr(0.78)＞Nb和316LSS(0.73)＞L605(0.71)
　　(3)全血浸泡后樣品表面XPS分析
　　樣品在全血中浸泡后，檢測到的表面成分主要為C，O和N，相對原子含量分別為:67.81％，13.99％和16.86％，并有少量的S，Cl，P，

21、Ca和Mg，相對含量分別為0.50％，0.26％，0.23％，0.23％和0.13％。
　　2、血液相容性
　　(1)血小板的粘附和活化
　?、傺“逭掣皆囼?
　　掃描電鏡2000倍視野下，可見血小板在各金屬樣品表面的分布狀態(tài)，部分區(qū)域可見血小板聚集。血小板的覆蓋面積分別為(％):Nb-60Ta-2Zr合金為30.8±5.6，Nb為29.1±7.2，Ta為28.1±7.5，316LSS為44±5.1，L605鈷

22、鉻合金為44.3±6.1。316LSS與L605鈷鉻合金之間的血小板覆蓋面積沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05），Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）。而316LSS與L605的血小板覆蓋面積顯著大于Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta(p＜0.05)。
　　掃描電鏡20000倍視野下，可見各金屬樣品表面的血小板呈分支樣鋪展，血小板之間的偽足相互接觸。Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta表面血小板

23、偽足較清晰，偽足間的鋪展面積較小;316LSS與L605偽足鋪展面積較大。
　?、谡掣窖“迦樗崦摎涿富钚?
　　5種金屬表面血小板粘附量(U/l):Nb-60Ta-2Zr合金為67.5±6.9，Nb為76.2±5.8，Ta為70.9±8.8，316LSS為83±8.8，L605鈷鉻合金為85.6±11.2。Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）;Nb、316LSS和L605鈷鉻合金之間沒有

24、統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）;316LSS和L605鈷鉻合金表面粘附的血小板數(shù)量明顯高于Nb-60Ta-2Zr合金和Ta（p＜0.05)
　　③血小板活化程度
　　5種金屬導(dǎo)致的血小板活化量為(ng/ml):Nb-60Ta-2Zr合金為42.1±2.3，Nb為45.2±2.8，Ta為42.5±1.3，316LSS為46.5±3，L605鈷鉻合金為48±3.3。Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.0

25、5）;Nb、316LSS和L605鈷鉻合金之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）;316LSS和L605鈷鉻合金引起的血小板活化明顯高于Nb-60Ta-2Zr合金和Ta（p＜0.05)。
　　(2)凝血
　　5種金屬的凝血時間PT、APTT、TT均在正常范圍之內(nèi)，分別為PT:11.8-12.23s;APTT:32.07-37.2s;TT:16.97-17.5s。其中Nb-60Ta-2Zr合金和Ta的PT和APTT的時間明顯長于N

26、b、316LSS和L605鈷鉻合金（p＜0.05）;而TT的時間，Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）;Nb、316LSS和L605鈷鉻合金之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）;316LSS和L605鈷鉻合金的TT明顯短于Nb-60Ta-2Zr合金和Ta（p＜0.05)
　　(3)溶血
　　各實驗組的溶血率(％):Nb-60Ta-2Zr合金為1.38±0.26，Nb為1.44±0.12，Ta

27、為1.38±0.10，316LSS為1.60±0.15，L605鈷鉻合金為1.62±0.13。均低于5％。各實驗組之間沒有差異（p＞0.05）。
　　3、人臍靜脈內(nèi)皮細胞在Nb-60Ta-2Zr表面的粘附與增殖
　　(1)材料表面細胞粘附的形態(tài)學(xué)觀察
　　HUVEC接種在樣品表面后，鏡下呈現(xiàn)出細胞特征性的形態(tài)，高倍鏡下可見細胞偽足，與材料貼附緊密，表面清晰生長狀態(tài)良好。隨著接種時間延長，鏡下細胞密度增加。實驗組和對照組

28、的細胞數(shù)量和形態(tài)未見差別。
　　(2)材料表面粘附細胞的VE-cadherin表達
　　Nb-60Ta-2Zr和316LSS表面粘附細胞的VE-Cadherin相對表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)
　　(3)材料表面細胞增殖實驗
　　隨著接種時間的延長，實驗組和對照組的OD值不斷提高，至7d達最高。實驗組和對照組的OD值無明顯差異（p＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、Nb-60Ta-2Zr表面吸附

29、的白蛋白和纖維蛋白原較316LSS和L605少。Nb-60Ta-2Zr、Nb、Ta、316LSS和L605的疏水性并不一定與白蛋白和纖維蛋白原的吸附量呈正相關(guān)。白蛋白和纖維蛋白原的吸附量與5種金屬材料表面自由能的極性部分關(guān)聯(lián)更為密切，極性部分能量越低，白蛋白和纖維蛋白原吸附量越高。
　　2、相對于316LSS和L605，Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta血小板的粘附活化程度較低，血小板的活化程度和粘附程度與材料表面粘附的纖維蛋