腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白Mtss1慢病毒干擾載體的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白Mtssl(Metastasis suppressor1；又名MIM，Missing in Metastasis)被認(rèn)為是一種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。已有報(bào)道顯示Mtssl參與細(xì)胞微絲系統(tǒng)的調(diào)控，具有強(qiáng)烈的細(xì)胞形態(tài)誘導(dǎo)功能。在細(xì)胞系中過量表達(dá)Mtssl可以誘導(dǎo)絲狀偽足類似結(jié)構(gòu)(filopoidia-like structure)與片狀偽足類似結(jié)構(gòu)(lamellipodia-like structure)的形成，并

2、導(dǎo)致應(yīng)力纖維(stress-fiber)的減少。同時(shí)，Mtssl的過量表達(dá)影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及相關(guān)背部變皺膜結(jié)構(gòu)(dorsal ruffl ing)。信號通路研究顯示它介入Src激酶，小GTPase Rac介導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)信號通路。
　　 然而，目前的報(bào)道還不能回答的一個(gè)問題，就是內(nèi)源Mtssl在生物體內(nèi)的功能究竟是什么?作為發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)，很多成熟分化的組織或細(xì)胞中的Mtssl均呈現(xiàn)非常低的表達(dá)，使得目前功能研究中使用

3、的細(xì)胞系中內(nèi)源Mtssl處于很低的狀態(tài)，功能研究多以過量表達(dá)的方式進(jìn)行。
　　 值得慶幸的是，Mtssl在小腦浦肯野神經(jīng)元發(fā)育成熟后仍維持較高水平的表達(dá)，這為內(nèi)源Mtssl功能研究模型的建立帶來了一線曙光。浦肯野神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中樹突結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的神經(jīng)元，并且分化后仍具有可塑性，是研究運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)的經(jīng)典模型之一。肌動(dòng)蛋白微絲系統(tǒng)在神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生和可塑性中起主要作用。伴有認(rèn)知障礙的神經(jīng)疾病以及神經(jīng)退行性疾病，經(jīng)常伴有細(xì)胞骨架蛋白

4、的異常。已有報(bào)道與我們未發(fā)表的結(jié)果表明，Mtssl在小腦出生后發(fā)育過程中呈現(xiàn)表達(dá)高峰并在成熟分化后維持較高表達(dá)，且Mtssl在該神經(jīng)元胞體、軸突與樹突中均有表達(dá)，暗示它可能參與該神經(jīng)元形態(tài)相關(guān)的功能。
　　 與過量表達(dá)(over-expression)相對，knock-down或knock-out技術(shù)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白表達(dá)降低或缺失是功能研究的常用手段之一，兩者相輔相成，結(jié)果互為印證。與knock out技術(shù)相比，knock down

5、技術(shù)要求低，投入少，已在功能研究中廣泛應(yīng)用。
　　 其中的RNA干擾技術(shù)(RNA interference RNAi)通過雙鏈RNA的介導(dǎo)，特異性阻抑相關(guān)序列的表達(dá)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。RNAi是一種高效的特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù)，近年來發(fā)展迅速，已被廣泛的應(yīng)用于功能基因組研究。
　　 慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾適用于包括神經(jīng)元在內(nèi)的非分裂期細(xì)胞，而且效率高。以它為工具來探索Mtssl在浦肯野神經(jīng)元中的功能比較合適，

6、所以在我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中擬采用慢病毒感染的方法對浦肯野神經(jīng)元的內(nèi)源Mtssl進(jìn)行knock down。
　　 為了制備針對Mtssl的高效慢病毒，我們首先針對小鼠Mtssl基因，利用Invitrogen公司的在線設(shè)計(jì)軟件BLOCK-ITTM RNAi Designer(https：//rnaidesigner.invitrogen.com/rnai)設(shè)計(jì)三對特異性shRNA序列。送至上海生物工程有限公司合成。
　　 接著，

7、為檢測這三段序列的有效性，我們將合成的shRNA片段連接到shRNA干擾載體pSUPER-retro-puro中，經(jīng)酶切和測序鑒定干擾載體構(gòu)建成功，將之瞬間轉(zhuǎn)染GFP-Mtssl過量表達(dá)的細(xì)胞系中，利用western blot檢測knock down的效率，結(jié)果顯示三段序列干擾效率均達(dá)60％以上。
　　 在驗(yàn)證了序列的有效性之后，利用EcoRⅠ-ClaⅠ雙酶切將含目的序列的DNA片段切下來連接到PLVTHM慢病毒質(zhì)粒中，經(jīng)酶切和

8、測序鑒定，表明Mtssl的慢病毒干擾載體構(gòu)建成功。
　　 此后，我們采用含有shRNA序列的慢病毒載體質(zhì)粒pLVTHM、衣殼蛋白質(zhì)粒pMD2.G和包裝蛋白質(zhì)粒psPAX2共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞的方法，制備慢病毒，經(jīng)純化后測定病毒滴度。用慢病毒感染GFP-Mtssl過量表達(dá)的細(xì)胞系中，再次利用western blot的方法測定慢病毒MtsslshRNA的有效性，結(jié)果顯示三段序列在慢病毒載體中的干擾效率也均達(dá)60％以上。
　　 為

9、進(jìn)一步探索這些慢病毒感染浦肯野神經(jīng)元的有效性，我們采用慢病毒感染原代培養(yǎng)的浦肯野神經(jīng)元，免疫熒光的初步結(jié)果顯示制備的慢病毒可以實(shí)現(xiàn)有效感染。由于浦肯野神經(jīng)元細(xì)胞不分裂增殖，每次原代培養(yǎng)獲得的浦肯野神經(jīng)元量較少。所以慢病毒介導(dǎo)的RNAi對浦肯野神經(jīng)元中的Mtssl的knock down的效率測定和進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)觀察有待繼續(xù)深入。
　　 總之，這個(gè)工作對于在細(xì)胞水平乃至整體動(dòng)物水平上研究內(nèi)源Mtssl在浦肯野神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生與功能方面