PD-1在冠心病患者外周血T細(xì)胞表達(dá)的意義及辛伐他汀的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)是人類健康的主要?dú)⑹?。心臟病流行病學(xué)調(diào)查資料表明,隨著生活方式的改變,我國(guó)的CHD患病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì),據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì):到2020年左右,我國(guó)會(huì)迎來(lái)冠心病的“流行”頂峰。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是冠心病發(fā)病的病理基礎(chǔ),人們從500年前埃及木乃伊的動(dòng)脈中就已發(fā)現(xiàn)粥樣硬化性病變。人類認(rèn)識(shí)AS是一種疾病并對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究已有

2、100余年的歷史。有關(guān)AS的發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)數(shù)量眾多,其中包括內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)、脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、血栓源性學(xué)說(shuō)、動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖學(xué)說(shuō)等。而自1999年Ross提出AS的炎癥反應(yīng)機(jī)制以來(lái),AS的炎癥反應(yīng)機(jī)制也已經(jīng)廣泛被醫(yī)學(xué)界認(rèn)可。研究證實(shí),炎癥參與了AS形成及發(fā)展的各個(gè)階段,直至最終的血栓并發(fā)癥。而近年來(lái),免疫因素在AS的發(fā)生發(fā)展中的作用正在被人們認(rèn)識(shí)并引起重視,更有學(xué)者提出.AS是一種自身免疫性疾病。在AS中,多種參與免疫細(xì)胞和炎癥因子構(gòu)成了錯(cuò)綜

3、復(fù)雜的相互協(xié)同、相互影響的網(wǎng)絡(luò),炎癥和免疫共同影響著AS的進(jìn)程。
　　 T淋巴細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞,參與特異性免疫反應(yīng),它與AS的關(guān)系國(guó)際上已有不少研究。AS的病理改變特點(diǎn)為平滑肌細(xì)胞增殖、脂質(zhì)沉積、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞形成。在人類AS的各個(gè)時(shí)期都有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),其中以T細(xì)胞為主?；顒?dòng)性斑塊與穩(wěn)定性斑塊比較,T細(xì)胞顯著增加。許多關(guān)于人類和嚙齒目動(dòng)物的研究證實(shí),T淋巴細(xì)胞促進(jìn)粥樣硬化斑塊的炎癥反應(yīng),影響損害的

4、進(jìn)展及重塑。主要表現(xiàn)在以下幾點(diǎn):1.T細(xì)胞與斑塊中其他免疫細(xì)胞及分子相互作用,促進(jìn)粥樣硬化；2.T細(xì)胞參與ox-LDL抗體、Hsp抗體等與.AS相關(guān)的自身抗體形成；3.殺傷性T細(xì)胞溶解破壞巨噬細(xì)胞,釋放大量促粥樣硬化物質(zhì)；4.T細(xì)胞在不穩(wěn)定性斑塊形成及斑塊破裂中可能起一定作用。
　　 T細(xì)胞活化是其發(fā)揮病理生理作用的前提。而T淋巴細(xì)胞的活化需要兩個(gè)信號(hào),第一個(gè)信號(hào)是T淋巴細(xì)胞表面的TCR-CD3復(fù)合物同抗原遞呈細(xì)胞(APC)上的

5、MHC-Ⅱ類抗原肽復(fù)合物結(jié)合,賦予免疫應(yīng)答的特異性,但不引起T細(xì)胞增生和分泌細(xì)胞因子；第二個(gè)信號(hào)是抗原非特異性的共刺激信號(hào),由T細(xì)胞上的共刺激分子與APC表面的配體結(jié)合所誘導(dǎo),啟動(dòng)維持并調(diào)節(jié)活化級(jí)聯(lián)反應(yīng),決定了T細(xì)胞是活化增殖,或者轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)反應(yīng)狀態(tài)甚至凋亡。重要的共刺激分子及其配基有:B7/CD28,血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1/遲現(xiàn)抗原(VLA)-4,細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1/淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原(LFA)-1,LFA-3/

6、CD2,CD40/CD40配基,CD70/CD27等。
　　 近年來(lái),一些新的共刺激分子陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),它們似乎在調(diào)節(jié)己活化的T細(xì)胞反應(yīng)中有獨(dú)特的重要性。負(fù)性共刺激分子PD-1(Programmed death-1)和其配體PD-L(Programmed death-1 ligand)相互作用提供淋巴細(xì)胞活化的抑制信號(hào),和正性共刺激信號(hào)形成了一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò),綜合調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),在免疫活化和耐受中起關(guān)鍵作用。
　　 PD-1

7、分子是免疫球蛋白超家族激活誘導(dǎo)的抑制性受體,是擁有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)的Ⅰ型跨膜蛋白,可誘導(dǎo)性表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞及骨髓細(xì)胞。PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)是PD-1的兩個(gè)配體,PD-L1主要表達(dá)在樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、激活的T細(xì)胞,在內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞上也有表達(dá),IFN-α、β、Y可上調(diào)其表達(dá)。PD-L2在樹突狀

8、細(xì)胞、單核細(xì)胞上表達(dá),IL-4、GM-CSF在體外強(qiáng)力誘導(dǎo)樹突細(xì)胞上PD-L2的表達(dá)。PD-1-PD-L結(jié)合后,發(fā)揮對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控作用,可抑制T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-10、IFN-Y等。在免疫反應(yīng)的起始部位和效應(yīng)部位雙重抑制免疫反應(yīng),防止過(guò)度的免疫損傷和自身免疫性疾病的發(fā)生,有利于維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)。
　　 PD-1負(fù)性共刺激信號(hào)的缺失會(huì)導(dǎo)致多種自身免疫性病變。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,PD-1信號(hào)缺失導(dǎo)致小鼠發(fā)生類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

9、及狼瘡樣自身免疫性腎炎,導(dǎo)致NOD小鼠自身免疫性糖尿病的快速進(jìn)展。增加PD-1負(fù)性共刺激信號(hào)可使AS兔粥樣斑塊中T細(xì)胞浸潤(rùn)減少及炎性反應(yīng)減輕,減輕實(shí)驗(yàn)性腦脊髓膜炎(EAE)程度,使脊髓浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞消失。近年來(lái)研究者們對(duì)PD-1在臨床疾病的表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn),病毒感染(如HBV、HIV)、寄生蟲感染、移植免疫、自身免疫病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化)、腫瘤等多種疾病,都存在PD-1及其配體PD-L的表達(dá)異常

10、,顯示出PD-1信號(hào)在對(duì)維持外周耐受及免疫自穩(wěn)方面起到保護(hù)性作用。
　　 他汀作為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,是有效的降脂藥物。除調(diào)脂作用之外,他汀還具有包括改善內(nèi)皮功能、增加NO生物利用率、抗氧化、穩(wěn)定斑塊、調(diào)節(jié)祖細(xì)胞、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多重血管保護(hù)作用。其抗炎及免疫調(diào)節(jié)方面的功效已在多種疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化的應(yīng)用中體現(xiàn)。
　　 AS是一個(gè)慢性炎癥反應(yīng),且具有自身免疫的特點(diǎn),而。PD-1在

11、其中的作用機(jī)理尚不清楚。本研究通過(guò)對(duì)免疫負(fù)性調(diào)控信號(hào)分子PD-1在CHD患者外周血T淋巴細(xì)胞(PBTC)的表達(dá)情況的檢測(cè),初步分析了其在AS發(fā)病及進(jìn)展中的意義；利用特異性PD-1阻斷抗體研究其對(duì)AS患者PBTC的免疫學(xué)調(diào)節(jié)作用,進(jìn)一步推測(cè)PD-1在AS中的調(diào)控機(jī)制；并通過(guò)觀察辛伐他汀(Sim)對(duì)PD-1在CHD患者PBTC上的表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,為他汀抗AS的免疫調(diào)節(jié)作用及PD-1作為AS免疫學(xué)治療新靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。
　　 第

12、一部分:CHD患者PBTC上PD-1的表達(dá)
　　 目的:研究PD-1在CHD患者PBTC上的表達(dá),初步探討其在AS發(fā)生發(fā)展中的意義。
　　 方法:選擇CHD患者(55例)為研究對(duì)象,其中穩(wěn)定性心絞痛(SA)患者27例,急性冠脈綜合征(ACS)患者28例,30例經(jīng)冠脈造影證實(shí)的非CHD患者為正常對(duì)照組,密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),分別用免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)及RT-PCR檢測(cè)PD-1蛋白及mRNA在T淋巴

13、細(xì)胞上的表達(dá)情況。
　　 結(jié)論:PD-1在CHD患者PBTC上的表達(dá)明顯降低,這可能在AS的發(fā)生及發(fā)展中起到作用。
　　 第二部分 PD-1對(duì)體外培養(yǎng)CHD患者PBTC的免疫學(xué)調(diào)控作用
　　 目的:研究PD-1對(duì)體外培養(yǎng)CHD患者PBTC的免疫學(xué)調(diào)控作用。
　　 方法:PBTC分離與純化同前。7例CHD患者和正常對(duì)照來(lái)自前一實(shí)驗(yàn)樣本人群。正常人及CHD患者的PBTC新鮮分離純化后,各分為4組,與另一健康人

14、來(lái)源的成熟樹突狀細(xì)胞(mDC)以20:1比例混合,置于37℃的CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng),72dx時(shí)后收集各組上清液ELISA法檢測(cè)IFN-Y、IL.4。3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入率反映T淋巴細(xì)胞的DNA合成。
　　 實(shí)驗(yàn)分組:1)PBTC組:PBTC加等體積的PBS作為陰性對(duì)照組；2)PBTC+mDC組:PBTC與mDC共培養(yǎng)；3)PBTC+mDC+PD-1Ig組:PBTC與mDC共培養(yǎng)體系中加入鼠抗人PD-1抗體(終濃度

15、為10 μg/ml)；4)PBTC+mDC+Ig組:PBTC與mDC共培養(yǎng)體系中加入鼠抗人同型對(duì)照Ig(終濃度為10μg/ml)。
　　 結(jié)論:CHD患者及正常人體內(nèi)PD-1共刺激分子在抑制PBTC增殖與分泌IFN-Y和IL-4發(fā)揮著重要的作用。CHD患者較正常人比較這種抑制作用相對(duì)減弱。
　　 第三部分 辛伐他汀對(duì)PD-1在CHD患者PBTC表達(dá)的調(diào)節(jié)作用
　　 目的:觀察辛伐他汀(Sim)對(duì)PD-1在CHD患

16、者PBTC表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,初步探討他汀藥物的免疫學(xué)調(diào)節(jié)AS的新機(jī)制。
　　 方法:取12例CHD患者新鮮外周血15ml,密度梯度離心法得到PBMC,并分為3個(gè)組:取分離出的CHD患者PBMC,同一患者細(xì)胞再分為空白對(duì)照組與Sim組:分別加入等體積的PBS與Sim(終濃度分別為10-6mol/L和10-5mol/L)。24小時(shí)小時(shí)后收集細(xì)胞,洗滌并調(diào)整濃度為5×105/ml。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-1在PBTC的表達(dá)。